Мышиные модели позволяют изучать ключевые механизмы аритмогенеза. Для этого необходимы высококачественные кардиомиоциты для проведения измерений патч-зажимом. Здесь описан метод выделения предсердных и желудочковых миоцитов мышей с помощью ретроградной ферментной перфузии Лангендорфа, который позволяет одновременно измерять кальциевые переходные процессы и кальциевый ток L-типа.
Мышиные модели играют решающую роль в исследованиях аритмии и позволяют изучать ключевые механизмы аритмогенеза, включая изменение функции ионных каналов и обращение с кальцием. Для этого необходимы высококачественные кардиомиоциты предсердий или желудочков для проведения измерений с помощью пластыря или для изучения аномалий обработки кальция. Однако ограниченный выход высококачественных кардиомиоцитов, полученных с помощью современных протоколов выделения, не позволяет проводить оба измерения на одной и той же мыши. В данной статье описывается метод выделения высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей с помощью ретроградной ферментной перфузии Лангендорфа для последующих одновременных измерений кальциевых переходных процессов и кальциевого тока L-типа у одного животного. Получаются мышиные сердца, а аорта быстро канюлируется для удаления крови. Затем сердца сначала перфузируют раствором, не содержащим кальция (37 ° C), чтобы диссоциировать ткань на уровне интеркалированных дисков, а затем раствором фермента, содержащим мало кальция, для разрушения внеклеточного матрикса (37 ° C). Переваренное сердце впоследствии рассекается на предсердия и желудочки. Образцы тканей измельчают на мелкие кусочки и растворяют путем осторожного пипетирования вверх и вниз. Ферментативное переваривание прекращается, и клетки постепенно возвращаются к физиологическим концентрациям кальция. После загрузки флуоресцентным Са2+-индикатором выделяют выделенные кардиомиоциты для одновременного измерения кальциевых токов и переходных процессов. Кроме того, обсуждаются подводные камни изоляции и предоставляются протоколы патч-зажима и репрезентативные следы кальциевых токов L-типа с одновременными переходными измерениями кальция в предсердных и желудочковых мышиных миоцитах, изолированных, как описано выше.
Сердечные аритмии являются распространенным явлением и одной из основных проблем здравоохранения в настоящее время, поскольку они затрагивают миллионы людей во всем мире. Аритмии связаны с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2 и представляют собой основную причину большинства внезапных сердечных смертей3. Современные варианты лечения улучшили выживаемость пациентов, но по-прежнему в основном являются симптоматическими методами лечения, а не нацелены на основные механизмы. Таким образом, эти методы лечения имеют ограниченную эффективность и часто могут вызывать серьезные побочные эффекты 4,5,6. Улучшение существующих вариантов лечения требует понимания лежащей в основе патофизиологии, что создает потребность в подходящих моделях для изучения. Модели мелких животных – и особенно модели мышей – играют решающую роль в исследованиях аритмии, поскольку они позволяют изучать ключевые механизмы аритмогенеза, например, генетическое влияние на клеточную электрофизиологию, функцию ионных каналов или обработку кальция 7,8.
Для этого требуются изолированные предсердные и желудочковые кардиомиоциты достаточного количества и жизнеспособности. Ранее был описан широкий спектр различных подходов к выделению для получения предсердных и желудочковых миоцитов 9,10,11,12,13, а некоторые группы представили данные одновременных измерений кальциевых переходных процессов L-типа и кальциевых токов либо из предсердий 14, либо из желудочков 15 мышиные кардиомиоциты. Однако, насколько нам известно, нет данных об измерениях предсердий и желудочков у одного животного. Исследователи сосредотачиваются на широком спектре тем, начиная от электрофизиологии и заканчивая протеомикой, функциональными исследованиями, такими как сократимость клеток или белковые взаимодействия, функция митохондрий или генетика – все это нуждается в изолированных кардиомиоцитах. Таким образом, многие из опубликованных протоколов не были специально разработаны для исследований пластырного зажима, что приводит к ограниченному выходу и недостаточному качеству клеток для исследований пластырного зажима. Таким образом, одновременные пластырные зажимы и кальциевые переходные измерения клеток предсердий и желудочков, выделенных от одного животного, не могут быть выполнены с установленными протоколами.
Выделение мышиных, особенно предсердных, миоцитов для экспериментов с пластырем остается сложной задачей. В этой статье представлен простой и быстрый метод выделения высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей с помощью ретроградной ферментной перфузии Лангендорфа, который впоследствии позволяет одновременно измерять как чистый мембранный ток, так и ток-индуцированные кальциевые переходные процессы у одного животного. В данной статье разработан протокол выделения предсердных и желудочковых миоцитов, полученных от мышей дикого типа и мышей, несущих генетические мутации. Этот протокол можно использовать как для самцов, так и для самок мышей. Выделение миоцитов, изображения и репрезентативные результаты, описанные ниже, были получены от мышей дикого типа C57Bl/6 в возрасте 6 (± 1) месяцев. Тем не менее, этот протокол успешно используется для мышей в разном возрасте от 2 до 24 месяцев с разными генотипами. На рисунке 1 показана установка изоляции и крупный план канюлированного сердца во время ферментной перфузии.
В этой статье представлен простой и функциональный способ получения высококачественных миоцитов предсердий и желудочков от одной и той же мыши для исследований с помощью пластыря с одновременными записями переходных процессов кальция. Качество полученных данных сильно зависит от ка…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Немецким научно-исследовательским обществом (DFG; Программа ученых-клиницистов в области сосудистой медицины (PRIME), MA 2186/14-1 для. Томсица и Д. Шюттлера; VO1568/3-1, IRTG1816 и SFB1002 проект A13 для Н. Фойгта), Немецкое научно-исследовательское общество в рамках Стратегии передового опыта Германии (EXC 2067/1-390729940 для Н. Фойгта), Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для С. Клаусса и Н. Фойгта; 81Z0600206 для С. Кяэба), Фонд Corona (S199/10079/2019 для С. Клаусса), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для С. Клаусса), Фонд Генриха и Лотте-Мюльфенцль (С. Клаусс) и Фонд Эльзе-Крёнер-Фрезениус (EKFS 2016_A20 Н. Фойгту). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
27G cannula | Servoprax | L10220 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
KCl | Merck | 1049360250 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
syringe | Merck | Z683531-100EA | |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |