Los modelos de ratón permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis. Para este propósito, los cardiomiocitos de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de parche y pinza. Aquí, se describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares a través de la perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, que permite mediciones simultáneas de transitorios de calcio y corriente de calcio de tipo L.
Los modelos de ratón desempeñan un papel crucial en la investigación de la arritmia y permiten estudiar los mecanismos clave de la arritmogénesis, incluida la función alterada del canal iónico y el manejo del calcio. Para este propósito, los cardiomiocitos auriculares o ventriculares de alta calidad son necesarios para realizar mediciones de patch-clamp o para explorar anomalías en el manejo del calcio. Sin embargo, el rendimiento limitado de cardiomiocitos de alta calidad obtenidos por los protocolos de aislamiento actuales no permite ambas mediciones en el mismo ratón. Este artículo describe un método para aislar miocitos aurinos y ventriculares murinos de alta calidad mediante perfusión de Langendorff retrógrada basada en enzimas, para mediciones simultáneas posteriores de transitorios de calcio y corriente de calcio tipo L de un animal. Se obtienen corazones de ratón y la aorta se canula rápidamente para eliminar la sangre. Los corazones se perfunden inicialmente con una solución libre de calcio (37 °C) para disociar el tejido a nivel de discos intercalados y luego con una solución enzimática que contiene poco calcio para alterar la matriz extracelular (37 °C). El corazón digerido se disecciona posteriormente en aurículas y ventrículos. Las muestras de tejido se cortan en trozos pequeños y se disuelven pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo. La digestión enzimática se detiene, y las células se reintroducen gradualmente a las concentraciones fisiológicas de calcio. Después de cargar con un indicador fluorescente de Ca2+, los cardiomiocitos aislados se preparan para la medición simultánea de corrientes y transitorios de calcio. Además, se discuten las trampas de aislamiento y se proporcionan protocolos de patch-clamp y trazas representativas de corrientes de calcio tipo L con mediciones transitorias simultáneas de calcio en miocitos murinos auriculares y ventriculares aislados como se describió anteriormente.
Las arritmias cardíacas son comunes y uno de los principales desafíos actuales de atención médica, ya que afectan a millones de personas en todo el mundo. Las arritmias se asocian con alta morbilidad y mortalidad 1,2 y representan la causa subyacente de la mayoría de las muertes súbitas cardíacas3. Las opciones de tratamiento actualizadas han mejorado la supervivencia del paciente, pero siguen siendo principalmente tratamientos sintomáticos en lugar de dirigirse a los mecanismos subyacentes. Por lo tanto, estos tratamientos tienen una eficacia limitada y con frecuencia pueden causar efectos secundarios graves 4,5,6. Una mejora de las opciones de tratamiento actuales requiere una visión de la fisiopatología subyacente, creando la necesidad de modelos adecuados para estudiar. Los modelos de animales pequeños, y específicamente los modelos de ratón, desempeñan un papel crucial en la investigación de arritmias, ya que permiten estudiar mecanismos clave de la arritmogénesis, por ejemplo, el impacto genético en la electrofisiología celular, la función del canal iónico o el manejo del calcio 7,8.
Para ello, se requieren cardiomiocitos auriculares y ventriculares aislados de cantidad y viabilidad suficientes. Se ha descrito previamente un amplio espectro de diferentes enfoques de aislamiento para obtener miocitos auriculares y ventriculares 9,10,11,12,13 y algunos grupos han presentado datos de mediciones simultáneas de corrientes de tipo L y transitorios de calcio inducidos por corriente de calcio de atrial 14 o ventricular 15 Cardiomiocitos murinos. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay datos disponibles de mediciones auriculares y ventriculares de un animal. Los investigadores se centran en una amplia variedad de temas que van desde la electrofisiología hasta la proteómica, estudios funcionales como la contractilidad celular o las interacciones de proteínas, la función mitocondrial o la genética, todos con necesidad de cardiomiocitos aislados. Por lo tanto, muchos de los protocolos publicados no se han desarrollado específicamente para estudios de pinza de parche, lo que lleva a rendimientos limitados y calidad celular insuficiente para estudios de pinza de parche. Por lo tanto, las mediciones simultáneas de pinza de parche y transitorios de calcio de células auriculares y ventriculares aisladas de un animal no se pueden realizar con los protocolos establecidos.
El aislamiento de miocitos murinos, especialmente auriculares, para experimentos de pinza de parche sigue siendo un desafío. Este artículo proporciona un método simple y rápido para el aislamiento de miocitos aurinos y ventriculares murinos de alta calidad a través de la perfusión de Langendorff basada en enzimas retrógradas, que posteriormente permite mediciones simultáneas de la corriente neta de la membrana y los transitorios de calcio inducidos por la corriente de un animal. Este artículo elabora un protocolo para el aislamiento de miocitos auriculares y ventriculares derivados de ratones de tipo salvaje y ratones portadores de mutaciones genéticas. Este protocolo se puede utilizar para ratones machos y hembras por igual. El aislamiento de miocitos, las imágenes y los resultados representativos que se describen a continuación se obtuvieron de ratones salvajes tipo C57Bl / 6 a la edad de 6 (± 1) meses. Sin embargo, este protocolo se ha utilizado con éxito en ratones de varias edades que van de 2 a 24 meses con diferentes genotipos. La figura 1 muestra la configuración de aislamiento y un primer plano de un corazón canulado durante la perfusión enzimática.
Este artículo proporciona una manera fácil y funcional de obtener miocitos auriculares y ventriculares de alta calidad del mismo ratón para estudios de parche y pinza con registros transitorios de calcio simultáneos. La calidad de los datos obtenidos depende en gran medida de la calidad del aislamiento celular. Como se mencionó anteriormente, muchos métodos para aislar cardiomiocitos murinos han sido descritos previamente 9,10,11,12.<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG; Clinician Scientist Program In Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. Tomsits y D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 y SFB1002 proyecto A13 a N. Voigt), Fundación Alemana de Investigación bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania (EXC 2067/1- 390729940 a N. Voigt), Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss y N. Voigt; 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), la ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss), la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss) y la Fundación Else-Kröner-Fresenius (EKFS 2016_A20 a N. Voigt). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
27G cannula | Servoprax | L10220 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
KCl | Merck | 1049360250 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
syringe | Merck | Z683531-100EA | |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |