Musmodeller gör det möjligt att studera nyckelmekanismer för arytmogenes. För detta ändamål är högkvalitativa kardiomyocyter nödvändiga för att utföra patch-klämmätningar. Här beskrivs en metod för att isolera murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, som möjliggör samtidiga mätningar av kalciumtransienter och kalciumström av L-typ.
Musmodeller spelar en avgörande roll i arytmiforskning och gör det möjligt att studera viktiga mekanismer för arytmogenes, inklusive förändrad jonkanalfunktion och kalciumhantering. För detta ändamål är förmaks- eller ventrikulära kardiomyocyter av hög kvalitet nödvändiga för att utföra patch-klämmätningar eller för att utforska kalciumhanteringsavvikelser. Det begränsade utbytet av högkvalitativa kardiomyocyter erhållna med nuvarande isoleringsprotokoll tillåter emellertid inte båda mätningarna i samma mus. Denna artikel beskriver en metod för att isolera högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, för efterföljande samtidiga mätningar av kalciumtransienter och kalciumström av L-typ från ett djur. Mushjärtan erhålls, och aortan kanyleras snabbt för att avlägsna blod. Hjärtan perfuseras sedan initialt med en kalciumfri lösning (37 °C) för att dissociera vävnaden vid nivån av interkalerade skivor och därefter med en enzymlösning som innehåller lite kalcium för att störa extracellulär matris (37 °C). Det smälta hjärtat dissekeras därefter i atria och ventriklar. Vävnadsprover hackas i små bitar och löses upp genom att försiktigt pipettera upp och ner. Den enzymatiska nedbrytningen stoppas och cellerna återinförs stegvis till fysiologiska kalciumkoncentrationer. Efter belastning med en fluorescerande Ca2+-indikator prepareras isolerade kardiomyocyter för samtidig mätning av kalciumströmmar och transienter. Dessutom diskuteras isoleringsfallgropar och patch-clamp-protokoll och representativa spår av kalciumströmmar av L-typ med samtidiga kalciumövergående mätningar i förmaks- och ventrikulära murina myocyter isolerade enligt beskrivningen ovan tillhandahålls.
Hjärtarytmier är vanliga och en av de nuvarande stora utmaningarna inom hälso- och sjukvården eftersom de påverkar miljontals människor världen över. Arytmier är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet 1,2 och utgör den bakomliggande orsaken till majoriteten av plötsliga hjärtdödsfall3. Uppdaterade behandlingsalternativ har förbättrat patienternas överlevnad men är fortfarande främst symptomatiska behandlingar snarare än inriktade på de underliggande mekanismerna. Således har dessa behandlingar begränsad effekt och kan ofta orsaka allvarliga biverkningar 4,5,6. En förbättring av nuvarande behandlingsalternativ kräver insikt i den underliggande patofysiologin, vilket skapar behov av lämpliga modeller att studera. Små djurmodeller – och specifikt musmodeller – spelar en avgörande roll i arytmiforskning eftersom de gör det möjligt att studera nyckelmekanismer för arytmogenes, till exempel den genetiska påverkan på cellulär elektrofysiologi, jonkanalfunktion eller kalciumhantering 7,8.
För detta ändamål krävs isolerade förmaks- och ventrikulära kardiomyocyter med tillräcklig mängd och livskraft. Ett brett spektrum av olika isoleringsmetoder för att erhålla förmaks- och ventrikulära myocyter har tidigare beskrivits 9,10,11,12,13 och vissa grupper har presenterat data från samtidiga mätningar av ström av L-typ och kalciumströminducerade kalciumtransienter från antingen förmak 14 eller ventrikulär 15 murina kardiomyocyter. Men så vitt vi vet finns det inga data tillgängliga om förmaks- och ventrikulära mätningar från ett djur. Forskare fokuserar på ett brett spektrum av ämnen som sträcker sig från elektrofysiologi till proteomik, funktionella studier som cellkontraktilitet eller proteininteraktioner, mitokondriell funktion eller genetik – allt i behov av isolerade kardiomyocyter. Många av de publicerade protokollen har därför inte utvecklats specifikt för patch clamp-studier, vilket leder till begränsade utbyten och otillräcklig cellkvalitet för patch clamp-studier. Således kan samtidiga lappklämmor och kalciumtransienta mätningar av förmaks- och ventrikulära celler isolerade från ett djur inte utföras med etablerade protokoll.
Isolering av murina – särskilt förmaksmyocyter för patchklämma experiment är fortfarande utmanande. Denna artikel ger en enkel och snabb metod för isolering av högkvalitativa murina förmaks- och ventrikulära myocyter via retrograd enzymbaserad Langendorff-perfusion, som därefter möjliggör samtidiga mätningar av både nettomembranström och ströminducerade kalciumtransienter från ett djur. Denna artikel utarbetar ett protokoll för isolering av förmaks- och ventrikulära myocyter härrörande från vilda möss och möss som bär genetiska mutationer. Detta protokoll kan användas för både manliga och kvinnliga möss. Myocytisoleringen, bilderna och representativa resultat som beskrivs nedan erhölls från möss av vildtyp C57Bl/6 vid 6 (± 1) månaders ålder. Ändå har detta protokoll framgångsrikt använts för möss i olika åldrar från 2 till 24 månader med olika genotyper. Figur 1 visar isoleringsinställningen och en närbild av ett kanylerat hjärta under enzymperfusion.
Denna artikel ger ett enkelt och funktionellt sätt att erhålla högkvalitativa förmaks- och ventrikulära myocyter från samma mus för patch-clamp-studier med samtidiga kalciumövergående inspelningar. Kvaliteten på de erhållna data beror i hög grad på kvaliteten på cellisoleringen. Som nämnts ovan har många metoder för att isolera murina kardiomyocyter beskrivits tidigare 9,10,11,12.</s…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av German Research Foundation (DFG; Clinician Scientist Program i vaskulär medicin (PRIME), MA 2186/14-1 till P. Tomsits och D. Schüttler; VO1568/3-1, IRTG1816 och SFB1002 projekt A13 till N. Voigt), tyska forskningsstiftelsen under Tysklands excellensstrategi (EXC 2067/1- 390729940 till N. Voigt), tyska centret för kardiovaskulär forskning (DZHK; 81X2600255 till S. Clauss och N. Voigt; 81Z0600206 till S. Kääb), Coronastiftelsen (S199/10079/2019 till S. Clauss), ERA-NET om hjärt-kärlsjukdomar (ERA-CVD; 01KL1910 till S. Clauss), Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (till S. Clauss) och Else-Kröner-Fresenius Foundation (EKFS 2016_A20 till N. Voigt). Finansiärerna hade ingen roll i manuskriptberedningen.
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | 31550 | |
27G cannula | Servoprax | L10220 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | A78403 | |
Anhydrous DMSO | Sigma-Aldrich | D12345 | |
Aortic cannula | Radnoti | 130163-20 | |
BaCl2 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
blunt surgical forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | |
Bovine Calf Serum | Sigma-Aldrich | 12133C | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | |
Circulating heated water bath | Julabo | ME | |
Collagenase Type II | Worthington | LS994177 | |
disscetion scissors | Kent Scientific | INS600124 | |
DL-aspartat K+-salt | Sigma-Aldrich | A2025 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fluo-3 | Invitrogen | F3715 | |
Fluo-3 AM | Invitrogen | F1242 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Guanosine 5′-triphosphate tris salt | Sigma-Aldrich | G9002 | |
Heating coil | Radnoti | 158821 | |
Heparin | Ratiopharm | 25.000 IE/5ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H9136 | |
induction chamber | CWE incorporated | 13-40020 | |
Isoflurane | Cp-pharma | 1214 | |
Jacketed heart chamber | Radnoti | 130160 | |
KCl | Merck | 1049360250 | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
MgCl x 6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | |
MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Na2HPO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | S5136 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Nylon mesh (200 µm) | VWR-Germany | 510-9527 | |
pasteur pipette | Sigma Aldrich | Z331759 | |
petri-dishes | Thermo Fisher | 150318 | |
Pluronic Acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
Roller Pump | Ismatec | ISM597D | |
surgical forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | |
surgical scissors | Kent Scientific | INS700540 | |
suturing silk | Fine Science Tools | NC9416241 | |
syringe | Merck | Z683531-100EA | |
Taurin | Sigma-Aldrich | 86330 |