Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kovalent mærkning med Diethylpyrocarbonat til at studere protein højere ordensstruktur ved massespektrometri

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/61983
Automatic Translation
1, 1, *1,2, *3
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
* These authors contributed equally

Summary

De eksperimentelle procedurer for udførelse af diethylpyrocarbonatbaseret kovalent mærkning med massespektrometrisk detektion er beskrevet. Diethylpyrocarbonat blandes simpelthen med det protein- eller proteinkompleks af interesse, hvilket fører til modifikation af opløsningsmiddeltilgængelige aminosyrerester. De modificerede restkoncentrationer kan identificeres efter proteolytisk fordøjelse og analyse af flydende kromatografi/massespektrometri.

Abstract

Karakterisere et protein's højere orden struktur er afgørende for at forstå dens funktion. Massespektrometri (MS) har vist sig at være et effektivt værktøj til dette formål, især for proteinsystemer, der er vanskelige at studere efter traditionelle metoder. For at studere et proteins struktur ved MS udføres specifikke kemiske reaktioner i opløsning, der koder et proteins strukturelle oplysninger i dets masse. En særlig effektiv tilgang er at anvende reagenser, der kovalent ændrer opløsningsmiddeltilgængelige aminosyrekæder. Disse reaktioner fører til masseforøgelser, der kan lokaliseres med opløsning på restniveau, når de kombineres med proteolytisk fordøjelse og tandemmassespektrometri. Her beskriver vi de protokoller, der er forbundet med brug af diethylpyrocarbonat (DEPC) som et kovalent mærkningsreagens sammen med MS-detektion. DEPC er et meget elektrofilt molekyle, der er i stand til at mærke op til 30% af resterne i det gennemsnitlige protein og derved give fremragende strukturel opløsning. DEPC er med succes blevet anvendt sammen med medlemsstaterne til at indhente strukturelle oplysninger om små enkeltdomæneproteiner, såsom β2-mikroglobulin, til store multidomæneproteiner, såsom monoklonale antistoffer.

Introduction

Proteiner er essentielle biomolekyler i stort set alle fysiologiske processer. De mange forskellige funktioner, som proteiner udfører, er mulige på grund af de strukturer, de vedtager, og de interaktioner, de har med andre biomolekyler. For at forstå proteinfunktionen på et dybere niveau er biokemiske og biofysiske værktøjer nødvendige for at belyse disse vigtige strukturelle træk og interaktioner. Traditionelt har røntgenkrystallografi, kryogen elektronmikroskopi og nuklear magnetisk resonansspektroskopi (NMR) givet den ønskede detaljeringsgrad på atomniveau for at afsløre proteinstrukturen. Men, talrige protein-systemer kan ikke afhøres af disse teknikker på grund af dårlig krystallisering adfærd, begrænset protein tilgængelighed, overdreven prøve heterogenitet, eller molekylær vægt begrænsninger. Derfor er der opstået nyere analysemetoder, der overvinder disse begrænsninger. Blandt de nye teknikker, der kan give protein strukturelle oplysninger er massespektrometri.

Massespektrometri (MS) måler et molekyles masse-til-ladning (m/z) forhold, så protein højere orden strukturelle oplysninger skal opnås ved kodning de ønskede strukturelle oplysninger i massen af proteinet. Der er udviklet flere metoder til indkode disse oplysninger, herunder udveksling af hydrogendeuterium (HDX)1,2,3,4, kemisk krydsning (XL)5,6og kovalent mærkning (CL)7,8,9,10. I HDX udveksles rygrad midt i brinter af lidt mere massive deuterier til priser, der afhænger af tilgængeligheden af opløsningsmidler og H-bindingsgraden. Omfanget af HDX kan lokaliseres ved hurtigt at fordøje proteinet i peptidfragmenter, før disse fragmenter adskilles og måles ved massespektrometeret eller ved at adskille proteinet i et top-down-eksperiment. Fastsættelsen af valutakursen giver yderligere indsigt i proteindynamik. HDX har vist sig at være et værdifuldt værktøj til at karakterisere proteinstruktur på trods af udfordringer forbundet med rygudveksling og behovet for specialiseret udstyr for at maksimere reproducerbarheden. I XL-MS reageres proteiner med bifunktionelle reagenser, der kovalent forbinder tilstødende restsidekæder med et givet protein eller mellem to proteiner. Dermed kan XL-MS give afstandsbegrænsninger, der kan bruges til at karakterisere proteinstrukturen. De regioner af proteinet, der er krydsbundet, kan identificeres ved proteolytisk fordøjelse efterfulgt af væskekromatografi (LC)-MS-analyse. Mens XL-MS er et alsidigt værktøj, der er blevet brugt til at studere en række proteinkomplekser, herunder inde i celler, er identifikation af XL-produkterne udfordrende og kræver specialiseret software.

CL-MS har for nylig vist sig som et supplerende og undertiden alternativt MS-baseret værktøj til at studere proteinstruktur og interaktioner. I CL-MS modificeres et protein- eller proteinkompleks kovalent med et monofunktionelt reagens, der kan reagere med opløsningsmiddeludsatte sidekæder (Figur 1). Ved at sammenligne modifikationsudvidelserne af et protein- eller proteinkompleks under forskellige forhold kan kropsbygningsændringer, bindingssteder og proteinproteingrænseflader afsløres. Efter CL-reaktionen kan stedsspecifikke oplysninger, ofte på enkelt aminosyreniveau, opnås ved hjælp af typiske bottom-up proteomics-arbejdsgange, hvor proteiner fordøjes proteolytisk, peptidfragmenter adskilles af LC, og modificerede steder identificeres ved hjælp af tandem MS (MS / MS). Den rige historie biokonjugat kemi har gjort mange reagenser til rådighed for CL-MS eksperimenter. CL-reagenser kan inddeles i to generelle kategorier: i) specifikke og ii) ikke-specifikke. Specifikke reagenser reagerer med en enkelt funktionel gruppe (f.eks. frie aminer)8,10 og er lette at implementere, men de har tendens til at give begrænsede strukturelle oplysninger. Ikke-specifikke reagenser reagerer med en bred vifte af sidekæder, men kræver ofte specialiseret udstyr såsom lasere eller synkrotronkilder til at producere disse meget reaktive arter. Hydroxylradikaler er de mest almindeligt anvendte ikke-specifikke reagenser, der er anvendt i hydroxylradikale fodaftryk (HRF)7,11,12,13 forsøg med at studere en bred vifte af proteiner og proteinkomplekser under forskellige forhold.

Vores forskningsgruppe har med succes brugt en anden relativt ikke-specifik reagens kaldet diethylpyrocarbonat (DEPC) til at studere proteinstruktur og interaktioner i forbindelse med CL-MS-eksperimenter14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC tilbyder enkelheden af specifikke mærkningsreagenser (dvs. intet specialiseret udstyr er nødvendigt for at udføre reaktionerne), mens det reagerer med op til 30% af aminosyrer i det gennemsnitlige protein. Som et meget elektrofilt reagens er DEPC i stand til at reagere med N-endestationen og de nukleofile sidekæder af cystein, histidin, lysin, tyrosin, serin og threoninerester. Typisk genereres et enkelt produkt af disse reaktioner, hvilket resulterer i en masseforøgelse på 72,02 Da. Denne enkelt type produkt står i kontrast til de op til 55 forskellige produkter, der kan produceres, når proteiner reagerer med hydroxylradikaler7. En sådan simpel kemi letter identifikationen af mærkede steder.

Her leverer vi protokoller til brug af DEPC-baseret CL-MS til at studere proteinstruktur og interaktioner. Detaljer i forbindelse med reagenspræparat, DEPC-proteinreaktioner, protein fordøjelsesforhold, LC-MS og MS / MS parametre, og dataanalyse er beskrevet. Vi demonstrerer også nytten af DEPC-mærkning ved at give eksempelresultater fra protein-metal, protein-ligand og proteinproteininteraktioner samt proteiner, der gennemgår strukturelle ændringer ved opvarmning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein og reagenspræparat

BEMÆRK: Denne protokol indeholder et eksempel på en arbejdsgang til mærkning af et protein med DEPC. Nogle af de anførte betingelser og reagenskoncentrationer kan variere afhængigt af det valgte protein.

  1. Forbered alle reagensopløsninger i 1,5 mL mikrocentrifugerør.
  2. Der fremstilles en proteinopløsning med den ønskede koncentration, normalt i intervallet μM, i en 10 mM 3-(N-morpholino)propansulfonsyrebuffer (MOPS) ved pH 7.4. Alternativt kan du fremstille en bufferbytter eksisterende proteinopløsning i 10 mM pH 7,4 MOPS, hvis prøven indeholder en nukleofil buffer, der ville være reaktiv med DEPC. Andre buffere (f.eks. fosfatbufferet saltvand) kan også anvendes, så længe de ikke har nukleofile funktionelle grupper.
  3. Der fremstilles en 100 mM DEPC-opløsning i tør acetonionstrif (ACN) ved at pipettere 1,45 μL af bestanden 6,9 M DEPC-opløsning til 98,55 μL af ACN.
    BEMÆRK: Der er ingen koncentrationer, der vil arbejde med hvert protein, selv om de optimale koncentrationer kan anslås baseret på antallet af His og Lys rester23. For eksempel reagerer proteinet med 50 μL af en 50 μM β2-mikroglobulinopløsning proteinet med 0,2 μL af 100 mM DEPC for en endelig DEPC-koncentration på 200 μM (svarende til 4x proteinkoncentrationen) for at sikre det ønskede molarforhold ved hjælp af dette generelle eksempel (tabel 1). DEPC-mærkning er en reaktion i andenklasse, så ændring af enten koncentrationen af protein eller DEPC i reaktionsblandingen vil ændre mærkningshastigheden.
  4. 1 M imidazolopløsning fremstilles ved at veje 10 mg imidazol ud og opløses i 146,9 μL HPLC-vand.

2. Kovalent mærkning af intakt protein

  1. Indstil vandbadtemperaturen til 37 °C, og vent på, at badet når en stabil temperatur.
    BEMÆRK: Reagenskoncentrationer og -mængder for eksempel mærkningsprotokol findes i tabel 1.
  2. I et nyt mikrocentrifugerør blandes MOPS-buffer og proteinopløsning i mængder, der er anført i tabel 1.
  3. Til proteinet og bufferen tilsættes 0,2 μL af DEPC-opløsningen, og sørg for at blande den resulterende opløsning korrekt, og placer derefter røret, der indeholder reaktionsblandingen, i 37 °C vandbadet i 1 minut.
    BEMÆRK: Mængden af TILsat ACN må ikke overstige 1 % af det samlede reaktionsvolumen for at undgå forstyrrelse af proteinets struktur under mærkningsreaktionen. Reaktionstiden er op til brugeren, selv om en 1 minuts reaktion under eksempelbetingelserne minimerer overmærkning og den potentielle hydrolyse af DEPC14.
  4. Efter 1 minut fjernes røret, der indeholder reaktionsblandingen, fra vandbadet, og reaktionen slukkes med 1 μL af 1 M imidazolopløsningen for at skylle den resterende ureagerede DEPC.
    BEMÆRK: Den endelige koncentration af imidazol i reaktionsblandingen skal svare til 50x koncentrationen af DEPC i reaktionsblandingen. Dette vil sikre, at de resterende ureagerede DEPC er scavenged.

3. Forberedelse af protein fordøje for bottom-up LC-MS

BEMÆRK: Vælg fordøjelsesforhold, der er modtagelige for det protein af interesse. Fælles skridt indebærer udfoldelse af proteinet og reduktion og alkylering af eventuelle disulfidbindinger.

  1. Fold proteinet ud ved at tilføje et passende udfoldende reagens til reaktionsblandingen.
    BEMÆRK: Almindelige udfoldelsesmidler omfatter ACN, urinstof og guanidinhydrochlorid (GuHCl).
  2. Der fremstilles opløsninger af tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) og iodoacetamid (IAM) ved at afveje 5 mg af hver og opløse dem i nye mikrocentrifugerør i henholdsvis 174,4 og 270,3 μL på henholdsvis 10 mM pH 7,4 MOPS-buffer til reduktions- og alkyleringstrin.
  3. Disulfidbindinger reduceres ved at tilsætte 2 μL af opløsningsblandingen med 100 mM TCEP (endelig koncentration på 2 mM i reaktionsblanding) til reaktionsblandingen og reagere i 3 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Den endelige koncentration af TCEP skal svare til 40x proteinkoncentrationen pr. disulfidbinding, der er til stede i opløsningen.
  4. Alkylat reducerede cystein med 4 μL af 100 mM IAM-opløsningen (endelig koncentration på 4 mM i reaktionsblanding) i 30 minutter i mørke. IAM er lysfølsom og nedbrydes under direkte lys.
    BEMÆRK: Den endelige koncentration af IAM i opløsning bør være dobbelt så stor som den koncentration, der anvendes til TCEP, eller 80x proteinkoncentrationen pr. disulfidbinding.
  5. Fordøje proteinet med et passende enzym som trypsin eller chymotrypsin. Et 10:1 protein:enzymforhold for en 3-timers fordøjelse ved 37 °C med immobiliseret enzym med en rystehastighed på 300 slag/min. er typisk tilstrækkeligt for DEPC-mærkede proteiner. Se Diskussion.
  6. Efter fordøjelsen adskilles det immobiliserede enzym fra de fordøjede peptider ved centrifugering ved 12.000 omdrejninger i rpm i 5 minutter.
  7. Prøven analyseres straks ved hjælp af LC-MS/MS, eller prøven fryses med flydende nitrogen for at minimere nedbrydningen af prøven og etikettabet. De flashfrosne prøver opbevares ved < -20 °C, indtil de er klar til LC-MS/MS-analyse.

4. LC-MS/MS-analyse

BEMÆRK: Standard LC-MS/MS parametre for bottom-up proteomics kan bruges til at identificere mærkede steder på proteolytiske peptidfragmenter. Et generelt eksempel er skitseret nedenfor.

  1. Adskil de DEPC-mærkede peptider ved hjælp af en omvendt fase C18 stationær fase. Brug en typisk LC-mobilfase af to opløsningsmidler: (A) vand + 0,1% myresyre og (B) ACN + 0,1% myresyre ved hjælp af en gradient (f.eks. figur 2) for at opnå den bedste adskillelse af peptider.
    BEMÆRK: Adskillelsestiden kan optimeres baseret på prøvekompleksitet, og mobil faseflowhastighed afhænger af, om kapillær eller nano-LC anvendes.
  2. Brug et massespektrometer, der er i stand til at udføre online LC-MS og MS/MS, til at identificere DEPC-modifikationssteder på peptid. I vores eksperimenter har vi med succes brugt flere typer massespektrometre. Ethvert massespektrometer, der er i stand til automatisk at udføre MS/MS af mange peptider i løbet af en LC-MS-analyse, bør være egnet. Relevante MS-parametre omfatter: ESI-kildespænding = -4000 V for almindelig ESI; -2000 V for nanospray Orbitrap opløsning = 60.000; Dynamisk udelukkelsesvarighed = 30 s; Ms/MS-aktiveringstype: CID, ETD eller begge dele; Massescanningsområde = 200-2.000; Automatisk forstærkningskontrol = 4.0E5 (MS1 i Orbitrap) og 5.0E4 (MS2 i lineær firdobbelt ionfælde).
  3. Indlæs og injicer den fordøjede, mærkede proteinprøve i remburssystemet, og start LC-MS/MS-anskaffelsen. Hvis prøven er flashfrosset, optøes før analyse. Omled LC-spildevandet til affald i de første 5 minutter for at undgå, at der kommer for store salte ind i ESI-kilden.
    BEMÆRK: Der anvendes generelt en 5 μL injektionssløjfe, som giver mulighed for injektion af ca. 2,5 μg protein til LC-MS/MS. Dette afhænger af lasteforholdene i rembursen, så prøveinjektoren ikke tilstopper den.

5. Dataanalyse

  1. Identificer DEPC-etiketsteder, og kvantificer peptidtopområder ved hjælp af passende software til det anvendte massespektrometer.
  2. Medtag DEPC-tilføjelse (72,02 Da) og carbamidomethylation (57,02 Da) som variable ændringer. Yderligere søgeparametre for MS/MS-analysen er følgende: Maksimalt antal glemte spaltninger = 3; Fragmentionstyper = b og y; Prækursor m/z tolerance = 10 ppm (denne værdi skal være højere, hvis der anvendes et firdobbelt ionfilterspektrometer). Fragment m/z tolerance = 0,5 Da (denne værdi skal være lavere, hvis der anvendes et massespektrometer med høj opløsning til en produktionscanning). Prækursorladning = 1-4.
    BEMÆRK: Forskellige databasesøgningsalgoritmer har forskellige pointsystemer, og mange kan have svært ved at identificere DEPC-modificerede peptider, fordi ændringsniveauerne kan være lave. Det kan være nødvendigt at justere score cutoff for at identificere mere mærkede peptider. Hvis det er tilfældet, bør der anvendes manuel forhør af MS/MS-dataene for at verificere peptider med lav score. Produktet af HYDROLYSEN AF DEPC-mærket er ikke inkluderet i datasøgningen, fordi den hydrolyserede DEPC ikke længere er reaktiv over for nukleofile sidekæder.
  3. Der fastsættes ændringsprocenter for restkoncentrationer ved hjælp af de kromatografiske spidsområder i de modificerede og uændrede versioner af peptider.
    BEMÆRK: Enhver peptid, der indeholder den modificerede rest af interesse, skal tages i betragtning, og alle de medfølgende ladestandere skal være til stede i alle de målte prøver. Peptider med forskellige ioniseringseffektiviteter og udredning på forskellige tidspunkter medfører, at denne værdi er en relativ snarere end et absolut mål for ændringen af et bestemt sted.
    Equation 1
    hvor Ai,z repræsenterer topareal af en given peptid (i), der indeholder rest af interesse og tager hensyn til alle påviste afgiftstilstande (z).
  4. Find ud af, om en etiketændring mellem et kontrolelement og en forsøgsprøve er signifikant ved hjælp af statistisk evaluering. Tre replikatmålinger for hver prøve er typiske, og t-test anvendes oftest med 95 eller 99% konfidensintervaller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifikation af DEPC-ændringssteder og ændringsprocenter
Massetilsætning på grund af kovalent mærkning kan måles ved (a) intakt protein og (b) peptidniveauer8,9. På intakt niveau kan der opnås en fordeling af proteinarter med forskellige antal etiketter fra direkte analyse eller LC-MS af mærkede proteinprøver. For at opnå strukturelle oplysninger med højere opløsning (dvs. stedspecifikke mærkningsdata) skal målingerne udføres på peptidniveau. Efter mærknings- og slukningstrinnene underkastes de mærkede proteiner en proteomic analyse af bottom-up(dvs. disulfidreduktion, alkylering, proteolytisk fordøjelse og LC-MS/MS). Figur 3 viser, hvordan de DEPC-mærkede lokaliteter identificeres, og deres modifikationsniveauer beregnes for et DEPC CL-MS-forsøg med protein β-2-microglobulin (β2m)21. MS/MS bruges til at sekvensere de mærkede peptider og lokalisere deres DEPC-mærkede steder, mens ændringsprocenter beregnes ud fra deres relative topområder i udvundne ionkromatogrammer (se figur 3A).

Kortlægning af proteinoverflade ved hjælp af DEPC CL-MS
På grund af forholdet mellem proteintopologi og mærkningshastighed er DEPC blevet brugt til at studere ændringer i proteinstrukturen med højere orden (HOS) og identificere proteininteraktionssteder8,9. Et eksempel er virkningen af Cu(II) bindende på strukturen af β2m. DEPC-ændringshastighedskoefficienter for peptidfragmenter fra ubundne β2m og Cu(II)-bundne β2m (b2m-Cu) kan måles (tabel 2) ved at variere DEPC-koncentrationerne og generere kinetiske parceller i anden klasse14,24. DEPC-reaktiviteten af restkoncentrationer i β2m-Cu afslører betydelige ændringer i mærkningshastigheden for His31, Ser33 og Thr4, mens andre steder, herunder forskellige hans rester, er statistisk uændrede. Disse data er i overensstemmelse med det faktum, at His31, men ikke andre hans rester i β2m, binder Cu forårsager strukturelle ændringer nær His31 (dvs. Ser33) og i nærheden af N-endestation (dvs. Thr4) (Figur 4)14,26,27.

DEPC CL-MS til identifikation af ændringer i HOS
DEPC mærkning med MS afsløring er også et værdifuldt værktøj til at karakterisere HOS ændringer i proteiner, som har vigtige konsekvenser for proteinterapi, som i øjeblikket er det hurtigst voksende segment af det farmaceutiske marked28. DEPC CL kan identificere specifikke proteinregioner, der undergår strukturelle ændringer ved termisk og oxidativ stress18. Efter at β2m er udsat for varmebelastning, er mange rester, der undergår betydelige fald i mærkningsudvidelser (N-endestation, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58), grupperet på den ene side af proteinet, hvilket tyder på, at denne del af proteinet gennemgår en kropsbygningsændring eller muligvis formidler sammenlægning (Figur 5A). Ud over disse rester udgør andre restkoncentrationer med et fald i mærkningen (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys941, Lys94) efter at have været udsat for oxidativ stress en klynge på en anden side af proteinet, hvilket indikerer, at de oxidationsfremkaldte kropsbygningsændringer forekommer andre steder (Figur 5B). Andet arbejde fra vores gruppe har også vist, at DEPC CL-MS kan opdage og identificere steder med konformationelle ændringer i varme-stressede monoklonale antistofbehandlinger20.

DEPC CL-MS til undersøgelse af protein-protein interaktioner
Indsigt i protein-protein interaktion steder og sammenlægning grænseflader for amyloid-dannende proteiner kan opnås ved hjælp af DEPC mærkning samt9. Fald i modifikationsniveauerne for restkoncentrationer på oligomerdannelse kan afsløre bindingsgrænsefladerne. DEPC CL-MS blev brugt til at karakterisere præ-amyloid oligomerer af β2m, som er det protein, der danner amyloider i dialyse-relateret amyloidose29, efter at have indledt amyloiddannelse med Cu (II)15,16,26. En sammenligning af DEPC-reaktiviteten af β2m-monomeren med den præ-amyloid β2m dimer, der dannes 2 timer efter tilsætning af Cu(II), viser, at ni restkoncentrationer undergår fald i mærkningen, mens seks rester ikke ændres eller øges mindre(figur 6A). Ved kortlægningen af disse ændringer på β2m er det umiddelbart klart, at dimergrænsefladen involverer ABED-β-ark af β2m monomerer (Figur 6B)15.

DEPC CL-MS til undersøgelse af protein-ligand binding
Ligand binding til proteiner fører til fald i opløsningsmiddeltilgængeligheden af rester, der interagerer med liganden, og DEPC-baserede CL-MS kan bruges til at identificere ligand-bindingssteder på proteiner. F.eks. kan de bindende steder for epigallocatechin-3-gallat (EGCG) på β2m under amyloiddannende tilstande identificeres ved betydelige fald i DEPC-mærkningen på de restkoncentrationer, der er begravet ved EGCG-binding. I nærværelse af ECGC har Lys6 og Lys91 lavere DEPC-ændringsprocenter (figur 7), og disse rester er grupperet i en region af proteinet, hvilket indikerer restbeskyttelse på grund af ligandbinding. N-endestationen, Thr4 og His31 gennemgår i mellemtiden stigninger i mærkningsudvidelser (figur 7), som er tegn på ECGC-inducerede strukturelle ændringer og tyder på, at de Cu(II) bindende steder på β2m (N-terminus og His31)14,30,31 kan blive forstyrret som følge af EFGC bindende32. Desuden er bindingsstederne for de to andre småmolekylehæmmere af β2m amyloiddannelse, rifamycin SV og doxycyclin, blevet identificeret ved hjælp af CL-MS19. I denne undersøgelse var resultaterne fra DEPC-mærkning alene imidlertid ikke nok til at kortlægge bindingsstederne med tilstrækkelig strukturel opløsning. Resultater fra tre forskellige CL-reagenser, nemlig DEPC, BD og 1-ethyl-3-((3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide - glycine ethylester (EDC/GEE) par var nødvendige for bedre at lokaliserebindingsstederne 19.

Forbedring af strukturopløsningen og reduktion af kapløbet om etiketter
Selv om DEPC-mærkning forårsager dannelse af en kovalent binding, kan der forekomme etikettab som følge af hydrolyse, især for ser-, thr- og tyrrester (figur 8). Etikettab kan minimeres ved at reducere tiden mellem DEPC CL-reaktion og LC-MS-analyse ved hjælp af korte proteolytiske fordøjelser (f.eks. 2 h fordøjelse med immobiliserede enzymer) snarere end natten over fordøjelser. Hurtige fordøjelser resulterer i, at der måles mere modificerede rester, hvilket øger mængden af proteinstrukturelle oplysninger. F.eks. fører en 2 timers fordøjelse med immobiliseret chymotrypsin konsekvent til identifikation af mere DEPC-modificerede restkoncentrationer i β2m (Figur 9)17. Med en overnattende fordøjelse påvises ca. 75% af ser-, Thr-, Tyr-, His- og Lys-restkoncentrationerne i β2m, men når tiden mellem mærkning og LC-MS reduceres ved hjælp af en 2 timers fordøjelse, opdages 95% af disse rester i β2m. De fleste af de nyligt påviste modificerede rester er Tyr- og Thr-rester, der er tilbøjelige til hydrolyse.

I løbet af vores arbejde med DEPC har vi bemærket, at Cys-rester fra disulfidbindinger i nogle proteiner ændres af DEPC, selvom disulfidbindingerne er intakte under DEPC-mærkningsreaktionerne. En sådan mærkning af Cys-rester sker, fordi frie thioler kan reagere med andre modificerede rester i opløsning (figur 10), hvilket fører til såkaldt "etiket scrambling", da carbethoxy-gruppen overføres til Cys-resterne. Label scrambling reducerer modifikationsniveauerne ved andre rester og giver forkerte proteinstrukturelle oplysninger. For at undgå etiket scrambling, den frie Cys thiols skal være fuldt udaldigtet lige efter disulfid reduktion33.

Figure 1
Figur 1:Kovalent mærkningsspektrometri (CL-MS). Et monofunktionelt reagens bruges til at modificere opløsningsmiddeltilgængelige aminosyrer og kan bruges til at give stedsspecifikke oplysninger om kropsbygningsændringer eller interaktionsgrænseflader i proteiner (top vs. bundbillede). Det modificerede protein fordøjes proteolytisk, og de resulterende peptider analyseres ved flydende kromatografi (LC) i forbindelse med MS og tandem MS (MS/MS). Figur er blevet tilpasset fra Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, RW Covalent Mærkning-Mass Spektrometri for at studere protein struktur og interaktioner. Metode 144, 79-93 (2018). Klik her for at se en større version af dette tal.

Anvendt volumen (μL) Koncentration i opløsning (μM)
Protein (100 μM, MOPS) 50 50
MOPS (10 mM, pH 7,4) 48.8 Nielsen
DEPC (100 mM) 0.2 200 (=4x[protein])
Imidazol (1 M) 1 10.000 (=50x[DEPC])
Samlet volumen 100

Tabel 1. Generel DEPC-mærkningsprotokol.

Figure 2
Figur 2. Eksempel LC gradient til adskillelse af peptider. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 Illustration af, hvordan DEPC-mærkede websteder identificeres, og deres ændringsniveauer beregnes. Efter DEPC-mærkning og proteolytisk fordøjelse udføres (A) LC-MS-analyse af det fordøjede protein. Topområder med (B) ikke-mærkede og (C) mærkede peptider i et kromatogram bruges til at beregne mærkningsprocenten. Under LC-MS udsættes peptider for CID MS/MS. Tandem massespektre af (D) umærkede og (E) &(F) mærkede peptider opnået på bestemte retentionstider anvendes til peptidsekvensering og identifikation af DEPC-mærkede steder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Rester b2m b2m-Cu
Thr4 0,082 ± 0,004 0,052 ± 0,009
His13 0,041 ± 0,003 0,033 ± 0,005
His31 0,010 ± 0,001 0,003 ± 0,001
Ser33 0,010 ± 0,002 0,004 ± 0,001
His51 0,036 ± 0,003 0,030 ± 0,004
Ser88 0,029 ± 0,007 0,020 ± 0,006

Tabel 2 Stedsspecifikke DEPC-ændringssatskoefficienter (k, M-1s-1) for b2m uden og tilstedeværelse af Cu(II).

Figure 4
Figur 4 Anvendelse af DEPC CL-MS til bestemmelse af virkningen af Cu(II) binding på strukturen af β2m: (A) Proteinoverfladekortlægning af restkoncentrationer med betydelige fald i DEPC-mærkningshastigheder (blå), der angiver ændringer i deres opløsningsmiddeltilgængelighed ved Cu(II) binding, og dem uden væsentlige ændringer i mærkningshastigheden (magenta) (FBF-tiltrædelseskode 1JNJ). (B) Eksempel på stedspecifikke kinetiske parceller af anden orden af reaktionen fra β2m med forskellige koncentrationer af DEPC i tilstedeværelsen og fraværet af Cu(II). Mærkningshastighedskoefficienten (k) kan fås fra det kinetiske plots hældning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 Kovalente mærkningsresultater for stresset vs. indfødt β2m: (A) Varmespænding - opvarmning ved 75 °C for 24 timer og (B) oxidativ stress - med 3% H2O2 for 24 timer. Væsentlige ændringer i ændringsprocenter er vist med blåt (fald i mærkning) og rød (stigning i mærkning), mens restkoncentrationer uden væsentlige mærkningsændringer er vist i lysegrøn (FBF-tiltrædelseskode 1JNJ). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 Brug af DEPC CL-MS til at bestemme dimergrænsefladen for præ-amyloid-dimeren på β2m: (A) Resumé af ændringer i DEPC-ændringsniveauet for modificerede rester i monomeren (dvs. t = 0) og dimer 2 timer efter tilsætning af Cu(II). Restkoncentrationer med betydelige fald i mærkningsudvidelsen betegnes med en stjerne (*). (B) Kovalent mærkning resultater kortlagt på β2m struktur. Restkoncentrationer med nedsat mærkning er vist med blåt, og restkoncentrationer uden ændringer eller mindre stigninger i mærkningen er vist med rødt (FBF-tiltrædelseskode 1LDS). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 Kovalent mærkningsresultater for EGCG-bundet vs. ubundet b2m. DEPC-ændringsprocenterne vises for de viste restkoncentrationer. Statistisk signifikante forskelle i den kovalente mærkningsprocent angives med en stjerne (*). Stigninger i mærkningen på ECGC-binding vises med rødt, mens fald vises med blåt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 DEPC-kovalent mærkningsreaktioner (nukleofil acylsubstitution) og etikettab (hydrolyse af carbethoxylaterede restkoncentrationer) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9 Kortlægning af de målte modifikationssteder på β2m. (A) Mærkede steder efter konventionel natten fordøjelse, og (B) mærket steder efter en 2 timers fordøjelse med immobiliseret chymotrypsin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10 Hypotese mekanisme DEPC etiket scrambling (Cys fangst af carbethoxylated Hans) Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin
Flere punkter vedrørende eksperimentelt design bør overvejes for at sikre pålidelige mærkningsresultater. For det første er det for at maksimere proteinmærkning nødvendigt at undgå buffere med stærkt nukleofile grupper (f.eks. Tris), fordi de kan reagere med DEPC og sænke omfanget af mærkning. Det er også tænkeligt, at sådanne buffere kan reagere med mærkede restkoncentrationer, hvilket medfører fjernelse af etiketten og dermed tab af strukturelle oplysninger. Vi anbefaler MOPS som buffer, men fosfat buffered saltvand fungerer også. For det andet bør dithiothreitol undgås ved reduktion af disulfidbindinger, fordi de frie thioler i dette reagens kan reagere med mærkede rester og fjerne DEPC-ændringen. Den samme kemi er grunden til, at det er vigtigt at alkylat reducerede disulfider, fordi frie Cys kan forårsage intraproteinmærke scrambling33. For det tredje er dæmpningstrinnet med imidazol (protokoltrin 2.4) afgørende for at stoppe mærkningsreaktionen, så eventuelle resterende DEPC ikke er i stand til at fortsætte med at reagere med proteinet.

Det er også vigtigt at forstå, at DEPC-mærkningsreaktionen er 2nd order, hvilket betyder, at ændring af enten protein- eller DEPC-koncentrationen vil påvirke omfanget af mærkning. Vi har empirisk konstateret, at et 4:1 DEPC:proteinkoncentrationsforhold er en rimelig værdi, når proteinet har en koncentration i 10'erne af μM-området, da det har tendens til at undgå mærkningsinducerede strukturelle ændringer14. Det optimale DEPC:proteinkoncentrationsforhold er imidlertid proteinafhængigt såvel som koncentrationsafhængigt, og nogle proteiner kræver højere forhold for at opnå tilstrækkelig mærkning. Den optimale DEPC-koncentration for at minimere den strukturelle forgiftning af mærkning af et givet protein kan anslås ud fra antallet af opløsningsmiddeltilgængelige His- og Lys-rester23.

For at undgå variabilitet i mærkningsudvidelser som følge af nedbrydning af reagens over tid bør kontrol- og forsøgsreaktionerne ideelt set udføres samme dag. DEPC gennemgår hurtig hydrolyse, når de udsættes for vand og vil nedbrydes under opbevaring så godt, så god lab praksis og reagens håndtering er nøglen. Når DEPC-lagerflasken ikke er i brug, skal den opbevares i en desiccator.

Ændringer og fejlfinding
Da DEPC CL er en kinetisk kontrolleret reaktion, styres mærkningshastigheden og dermed modifikationsniveauet af protein- og reagenskoncentrationer, mærkningstid og temperatur. Som nævnt ovenfor udføres DEPC CL ofte i 1 minut ved 37 °C med et DEPC- til proteinmolarforhold på 4 til 1. Ved dette kindforhold (4x) kan proteiner mærkes sikkert uden strukturelle perturbationer14. DEPC:proteinmolarforhold, der er større end 4, kan bruges til nogle proteiner, og ikke overraskende højere DEPC-koncentrationer resulterer i mere omfattende mærkning og mere strukturel information. Den sikreste måde at anvende højere DEPC-koncentrationer uden forstyrrende struktur på er at generere dosisresponsområder, hvor reaktiviteten af et proteins proteolytiske fragmenter måles som en funktion af DEPC-koncentrationen (se figur 4B)14,24. Denne tilgang kan dog være tidskrævende, da den kræver flere målinger. For nylig har vi vist, at den optimale DEPC koncentration kan anslås for et givet protein fra antallet og SASA af hans og Lys rester i dette protein23. I det seneste arbejde har vi også foreslået alternative måder at vurdere, at et proteins struktur ikke forstyrres under CL9,24.

Proteolytisk fordøjelse er også et vigtigt skridt i DEPC CL-MS, da de peptider, der genereres, giver en mulighed for at lokalisere strukturelle oplysninger efter LC-MS/MS-analyse. Generelt er serinproteaser som trypsin og chymotrypsin effektive til protein fordøjelse. Trypsin er mere almindeligt anvendt på grund af sin kavalergang effektivitet og specificitet på C-terminal side af Lys og Arg rester. Trypsin kløver dog normalt ikke efter DEPC-mærkede Lys-rester, hvilket forårsager glemt kavalergang ved mærkede Lys-rester, der undertiden kan komplicere dataanalysen. Chymotrypsins aktivitet, som kløver efter voluminøse hydrofobe rester, påvirkes typisk ikke af DEPC-mærkning, men dette enzym har lavere kavalergangseffektivitet og specificitet end trypsin. Derudover kan chymotrypsin for proteiner med mange hydrofobe rester generere flere korte peptidfragmenter, der kan være vanskelige at adskille og detektere under standard LC-MS-forhold.

LC-ESI-MS/MS-analyser af protein fordøjer kræver en stabil elektrospray for at opnå pålidelige semikvantitative resultater. Kapillær og nano LC er almindeligt anvendte separationsplatforme, hvor effektiv adskillelse kan opnås med små mængder protein. Det er imidlertid vores erfaring, at kapillær LC giver mere pålidelige kvantitative oplysninger (dvs. modifikationsniveauer) end nano-LC på grund af de højere prøvemængder, der bruges. For store proteiner, der fordøjes til et stort antal mærkede og umærkede peptider, kan coelution af peptider med lignende hydrofobitet ske. I disse tilfælde bør længere LC-gradienter anvendes til bedre separationer.

Hurtig og effektiv MS/MS er vigtig for god sekvensdækning og identifikation af etiketwebsted. Massespektrometre med firdobbelige ionfælder er fremragende instrumenter til dette formål. Generelt er CID en almindelig og yderst effektiv metode til peptidafkobling; Vi har dog observeret tilfælde af DEPC-etiket scrambling under CID af mærkede peptidioner, hvilket resulterer i tvetydighed i mærkningen af webstedsidentitet34. I disse noget sjældne tilfælde giver ETD oplysninger, der er mere pålidelige. Derfor, hvis det er muligt, skiftevis mellem begge dissociation teknikker kan være nyttigt. Da DEPC kan mærke mange forskellige resttyper, er det almindeligt, at isomerer af et givet peptidfragment genereres, som adskiller sig i den sidekæde, der ændres. Mange gange kan disse peptid isomerer adskilles af LC, selv om de har tendens til at elute på meget lignende tidspunkter. Denne sandsynlighed bør tages i betragtning, når der fastsættes ms/ms-udelukkelsestider under automatiserede LC-MS/MS-analyser. Typisk bør kortere udelukkelsestider end normalt anvendes.

Begrænsninger
Mens DEPC CL-MS er enormt gavnligt for at studere protein struktur og interaktioner, og der er gjort betydelige fremskridt for at løse en bred vifte af proteinsystemer, nogle begrænsninger af denne teknik tilbage. Hvis mærkningsbetingelserne ikke er godt optimeret (f.eks. ved hjælp af en for høj koncentration af DEPC), kan overmærkning forstyrre proteinstrukturen og resultere i unøjagtige strukturelle oplysninger14,23,24. Desuden påvirkes nøjagtigheden og præcisionen af de målte modifikationsniveauer af flere faktorer, herunder etikettab, hvis prøverne sidder for længe før LC-MS-analyse og fejl i de kemiske mærkningstrin. Konsistens i hvert eksperimentelt trin er vigtigt for pålidelige resultater. Et af de mere udfordrende problemer, der i øjeblikket er forbundet med DEPC-baseret CL-MS, er dataanalysesoftware. Let tilgængelige dataanalyseprogrammer er ikke optimeret til at identificere peptider med lave ændringsprocenter (f.eks. < 1%). Derfor har vi udviklet og brugt specialiseret software til at gøre det muligt peptider med lave modifikationsniveauer let at identificere18.

Selvom DEPC CL-MS kan give moderat protein strukturel opløsning, en detaljeret 3D-struktur kan ikke opnås fra mærkning teknik. For nylig er nogle strukturelle forudsigelsesværktøjer baseret på mærkningsdata blevet udviklet35,36. Der er dog behov for flere udviklinger for optimalt at indarbejde DEPC-mærkningsresultater med beregningsmodellering for at forudsige proteinstrukturen.

Betydning sammenlignet med alternative metoder
Den strukturelle opløsning, der er mulig med DEPC-baseret CL-MS, er moderat sammenlignet med teknikker som røntgenkrystallografi eller NMR, så det er mest hensigtsmæssigt at sammenligne teknikken med HDX-MS, XL-MS og andre CL-MS- eller fodaftryksmetoder. Som det blev nævnt i indledningen, supplerer CL-MS HDX-MS, fordi det giver oplysninger om sidekæderne af rester i et protein, mens HDX-MS rapporterer om rygradsstruktur og dynamik. Denne komplementaritet gør det muligt at bruge de to teknikker sammen for at få mere strukturelle oplysninger , som det fremgår af flere grupper37,38,39,40,41. En ny idé, der er relevant for DEPC-baseret CL-MS, er de synergistiske oplysninger, der er tilgængelige , når de bruges sammen med HDX-MS22. På grund af de tidsrammer, der er forbundet med de to teknikker, kan DEPC-baserede CL-MS ofte afklare tvetydighed med proteinregioner, der gennemgår nedsat HDX. Nedsat HDX kan opstå som følge af enten reduceret tilgængelighed af opløsningsmidler på grund af binding eller nedsat proteindynamik. DEPC-reaktioner er i sagens natur 2-3 størrelsesordener langsommere end HDX-reaktioner, så DEPC-mærkning er stort set upåvirket af ændringer i proteindynamikken, så længe de ikke ledsages af ændringer i tilgængeligheden af opløsningsmidler.

CL-MS har nogle fordele i forhold til HDX-MS eksperimenter i denne etiket scrambling og etiket tab er minimal, når passende forholdsregler er taget. I HDX-eksperimenter er etikettab eller back-exchange et standardtræk ved teknikken, og hurtige fordøjelser og LC-separationer ved lav pH er forsøg på at minimere dette problem. Det er dog vigtigt at erkende, at back exchange-problemet opvejes af det højere antal mærkede websteder, der typisk måles i HDX-MS. Mærkning scrambling er et større problem i HDX-MS, fordi forkerte oplysninger så ville blive indhentet, så analysebetingelserne skal optimeres for at minimere denne bekymring.

XL-MS og CL-MS har lignende fordele med hensyn til etikettab og scrambling, da begge involverer dannelsen af en kovalent binding, der er robust nok til at forblive under fordøjelsen og LC-MS-analyser. Sekventering og identifikation af krydsforbundne peptider er imidlertid mere udfordrende end for kovalent mærkede peptider, der kræver brug af specialiseret software. En vigtig fordel, som XL-MS har over CL-MS, er dens evne til at levere afstandsbegrænsninger, hvilket kan være værdifuldt, når man forudsiger eller indsnævrer mulige proteinstrukturer. CL-MS-data er blevet brugt til at lette forudsigelse af proteinstruktur36,42,43, men dette område kræver mere arbejde for fuldt ud at nå sit potentiale.

Sammenlignet med andre CL-MS-metoder, herunder dem, der bruger specifikke eller ikke-specifikke mærkningsreagenser, har DEPC nogle fordele og ulemper. Ligesom metoder, der bruger aminosyrespecifikke reagenser, er DEPC-mærkning ligetil; reagenset kun skal lægges til den prøve, der er af interesse. Denne enkelhed står i kontrast til metoder som hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) eller synkrotronbaseret HRF, der kræver sofistikerede lyskilder til fremstilling af hydroxylradikaler. I modsætning til metoder, der bruger specifikke reagenser, kan DEPC mærke seks forskellige aminosyrer og N-endestationen, så den kan give højere strukturel opløsning. Antallet af restkoncentrationer, der kan mærkes af DEPC, er dog færre end det antal, der kan oxideres af hydroxylradikaler, så den strukturelle opløsning, der kan opnås af DEPC-baserede CL-MS, er lavere. En praktisk forgrening af færre restkoncentrationer, der mærkes af DEPC, er, at brugen af reagenset nogle gange ikke giver alle ønskede strukturelle oplysninger, og derfor kan det drage fordel af at blive brugt sammen med andre mærkningsreagenser. Vi har for nylig påvist værdien af at bruge DEPC sammen med reagensparret 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)/glycin ethylether (GEE), som kan mærke glutamat og aspartatrester19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender støtte fra National Institutes of Health (NIH) under Grant R01 GM075092. Thermo Orbitrap Fusion massespektrometer bruges til at erhverve nogle af de data, der er beskrevet her blev erhvervet med midler fra National Institutes of Health tilskud S10OD010645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Thermo Fisher Scientific 3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Millipore Sigma M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt Millipore Sigma M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column Thermo Scientific 164537 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile Fisher Scientific A998-1
Diethylpyrocarbonate Millipore Sigma D5758
HPLC-grade water Fisher Scientific W5-1
Imidazole Millipore Sigma I5513
Immobilized chymotrypsin ProteoChem g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated Thermo Fisher Scientific 20230
Iodoacetamide Millipore Sigma I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine Millipore Sigma C4706

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Tags

Kemi Problem 172 Massespektrometri kovalent mærkning protein højere ordensstruktur protein-ligand komplekser proteinkomplekser diethylpyrocarbonat opløsningsmiddeltilgængeligt overfladeareal
Kovalent mærkning med Diethylpyrocarbonat til at studere protein højere ordensstruktur ved massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, … More

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (172), e61983, doi:10.3791/61983 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter