De experimentella förfarandena för att utföra diethylpyrocarbonate-baserade kovalement märkning med massa spektroskopisk detektion beskrivs. Diethylpyrocarbonat blandas helt enkelt med protein- eller proteinkomplexet av intresse, vilket leder till modifiering av lösningsmedelskomliga aminosyrarester. De modifierade resterna kan identifieras efter proteolytisk matsmältning och vätskekromatografi/masspektrometrianalys.
Att karakterisera ett proteins högre ordningsstruktur är avgörande för att förstå dess funktion. Masspektrometri (MS) har dykt upp som ett kraftfullt verktyg för detta ändamål, särskilt för proteinsystem som är svåra att studera med traditionella metoder. För att studera ett proteins struktur av MS utförs specifika kemiska reaktioner i en lösning som kodar ett proteins strukturella information i sin massa. Ett särskilt effektivt tillvägagångssätt är att använda reagenser som kovalent modifierar lösningsmedel tillgängliga aminosyra sidokedjor. Dessa reaktioner leder till massökningar som kan lokaliseras med restnivåupplösning i kombination med proteolytisk matsmältning och tandemmasspektrometri. Här beskriver vi protokollen i samband med användning av diethylpyrocarbonat (DEPC) som ett kovallt märkningsreagens tillsammans med MS-detektion. DEPC är en mycket elektrofil molekyl som kan märka upp till 30% av resterna i det genomsnittliga proteinet, vilket ger utmärkt strukturell upplösning. DEPC har framgångsrikt använts tillsammans med MS för att erhålla strukturell information för små endomänproteiner, såsom β2-mikroglobulin, till stora multidomänproteiner, såsom monoklonala antikroppar.
Proteiner är viktiga biomolekyler i praktiskt taget alla fysiologiska processer. De olika funktioner som proteiner utför är möjliga på grund av de strukturer de antar och de interaktioner som de har med andra biomolekyler. För att förstå proteinfunktionen på en djupare nivå behövs biokemiska och biofysiska verktyg för att belysa dessa viktiga strukturella egenskaper och interaktioner. Traditionellt har röntgenkristallografi, kryogen elektronmikroskopi och kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) gett önskad detalj på atomnivå för att avslöja proteinstrukturen. Många proteinsystem kan dock inte förhöras av dessa tekniker på grund av dåligt kristalliseringsbeteende, begränsad proteintillgänglighet, överdriven prov heterogenitet eller molekylär vikt begränsningar. Följaktligen har nyare analysmetoder dykt upp som övervinner dessa begränsningar. Bland de framväxande teknikerna som kan ge proteinstrukturinformation är masspektrometri.
Masspektrometri (MS) mäter en molekyls massa-till-laddning (m/z) förhållande, så protein högre ordning strukturell information måste erhållas genom kodning av önskad strukturell information i proteinets massa. Flera metoder för att koda denna information har utvecklats, inklusive vätedeuteriumutbyte (HDX)1,2,3,4, kemisk korslänkning (XL)5,6och kovamerad märkning (CL)7,8,9,10. I HDX utbyts ryggraden bland väten av något mer massiva deuteriums i takt som är beroende av lösningsmedelstillgänglighet och H-bindningsgrad. Omfattningen av HDX kan lokaliseras genom att snabbt smälta proteinet i peptidfragment innan dessa fragment separeras och mäts med masspektrometern eller genom att proteinet dissocieras i ett uppifrån och ned-experiment. Att bestämma växelkursen ger ytterligare insikt i proteindynamiken. HDX har visat sig vara ett värdefullt verktyg för att karakterisera proteinstrukturen trots utmaningar i samband med back exchange och behovet av specialiserad utrustning för att maximera reproducerbarheten. I XL-MS reageras proteiner med bifunktionella reagenser som kovavrätt kopplar samman intilliggande rester sidokedjor inom ett visst protein eller mellan två proteiner. På så sätt kan XL-MS ge avståndsbegränsningar som kan användas för att karakterisera proteinstrukturen. De regioner av proteinet som är korslänkade kan identifieras genom proteolytisk matsmältning följt av flytande kromatografi (LC)-MS analys. Medan XL-MS är ett mångsidigt verktyg som har använts för att studera en mängd olika proteinkomplex, inklusive inuti celler, är identifiering av XL-produkterna utmanande och kräver specialiserad programvara.
CL-MS har nyligen dykt upp som ett kompletterande och ibland alternativt MS-baserat verktyg för att studera proteinstruktur och interaktioner. I CL-MS modifieras ett protein- eller proteinkomplex kovaly med ett monofunktionellt reagens som kan reagera med lösningsmedelsexponerade sidokedjor (figur 1). Genom att jämföra modifierings utsträckningerna av ett protein- eller proteinkomplex under olika förhållanden kan konformationsförändringar, bindningsställen och proteinproteingränssnitt avslöjas. Efter CL-reaktionen kan platsspecifik information, ofta på en enda aminosyranivå, erhållas med typiska proteomiska arbetsflöden nedifrån och upp där proteiner proteolytiskt smälts, peptidfragment separeras av LC och modifierade platser identifieras med tandem MS (MS/MS). Biokonjugatkemins rika historia har gjort många reagenser tillgängliga för CL-MS-experiment. CL-reagenser tillhör två allmänna kategorier: i) specifika och ii) icke-specifika. Specifika reagenser reagerar med en enda funktionell grupp (t.ex. fria aminer)8,10 och är lätta att genomföra, men de tenderar att ge begränsad strukturell information. Icke-specifika reagenser reagerar med ett brett spektrum av sidokedjor, men kräver ofta specialiserad utrustning som lasrar eller synkrotronkällor för att producera dessa mycket reaktiva arter. Hydroxylradikaler är det vanligaste icke-specifika reagenset, efter att ha applicerats i hydroxylradikala fotavtryck (HRF)7,11,12,13 experiment för att studera ett brett spektrum av proteiner och proteinkomplex under en mängd olika förhållanden.
Vår forskargrupp har framgångsrikt använt ett annat relativt icke-specifikt reagens som kallas diethylpyrocarbonat (DEPC) för att studera proteinstruktur och interaktioner i samband med CL-MS-experiment14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC erbjuder enkelheten hos specifika märkningsreagenser (dvs. ingen specialiserad utrustning är nödvändig för att utföra reaktionerna), samtidigt som den reagerar med upp till 30% aminosyror i det genomsnittliga proteinet. Som ett mycket elektrofilt reagens kan DEPC reagera med N-ändstationen och de nukleofila sidokedjorna cystein, histidin, lysin, tyrosin, serin och treoninrester. Vanligtvis genereras en enda produkt av dessa reaktioner, vilket resulterar i en massökning på 72,02 Da. Denna enda typ av produkt står i kontrast till de upp till 55 olika produkter som kan produceras när proteiner reagerar med hydroxylradikaler7. Sådan enkel kemi underlättar identifiering av märkta platser.
Här tillhandahåller vi protokoll för att använda DEPC-baserade CL-MS för att studera proteinstruktur och interaktioner. Detaljer i samband med reagenspreparat, DEPC- proteinreaktioner, proteinsammanfattning, LC-MS- och MS/MS-parametrar samt dataanalys beskrivs. Vi demonstrerar också nyttan av DEPC-märkning genom att tillhandahålla exempelresultat från protein-metall- och protein-ligand- och proteinproteininteraktioner samt proteiner som genomgår strukturella förändringar vid uppvärmning.
Kritiska steg
Flera punkter om experimentell utformning bör övervägas för att säkerställa tillförlitliga märkningsresultat. För det första, för att maximera proteinmärkningen är det nödvändigt att undvika buffertar med starkt nukleofila grupper (t.ex. Tris) eftersom de kan reagera med DEPC och sänka etikettens omfattning. Det är också tänkbart att sådana buffertar skulle kunna reagera med märkta restprodukter, vilket leder till att etiketten tas bort och därför förlust av strukturell i…
The authors have nothing to disclose.
Författarna bekräftar stöd från National Institutes of Health (NIH) under Grant R01 GM075092. Thermo Orbitrap Fusion masspektrometer som används för att förvärva några av de data som beskrivs här förvärvades med medel från National Institutes of Health grant S10OD010645.
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |