Summary
私たちは、 眠れる森の美女 (SB)トランスポゾンシステムを用いて色素上皮由来因子(PEDF)をコードする遺伝子をエレクトロポレーションすることにより、初代ヒト色素上皮細胞をトランスフェクトするプロトコルを開発しました。トランスフェクションの成功は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)、イムノブロッティング、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって実証されました。
Abstract
高齢化が進む社会では、神経変性疾患の発生率も高まっています。これまでのところ、病理学的メカニズムは十分に理解されていないため、定義された治療法の確立を妨げています。保護因子の発現を増加させるための細胞ベースの相加遺伝子治療は、加齢黄斑変性症(AMD)などの神経変性疾患を治療するための有望な選択肢と考えられています。眠れる森の 美女 (SB)トランスポゾンシステムを用いて、神経系の神経保護・抗血管新生タンパク質として特徴付けられる色素上皮由来因子(PEDF)をコードする遺伝子を初代ヒト色素上皮(PE)細胞のゲノムに安定的に発現させる方法を開発しました。初代PE細胞をヒトドナーの眼から単離し、培養中に維持した。コンフルエントに達した後、1 x 104 細胞を11 μLの再懸濁バッファーに懸濁し、30 ngの高活性 SB (SB100X)トランスポザーゼプラスミドと470 ngの PEDF トランスポゾンプラスミドを含む2 μLの精製溶液と組み合わせました。遺伝子組み換えは、以下のパラメータを用いて毛細管エレクトロポレーションシステムで行った:電圧1,100Vおよび幅20msの2つのパルス。トランスフェクトした細胞を、ウシ胎児血清を添加した培地を含む培養プレートに移した。抗生物質および抗真菌剤を最初の培地交換で添加した。トランスフェクションの成功は、独立して実施された実験で実証されました。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、 PEDF 導入遺伝子の発現の増加を示した。PEDF分泌は、イムノブロッティングによって評価され、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって定量されるように、有意に上昇し、安定したままであった。 SB100Xを介した導入は、PE細胞のゲノムへの安定したPEDF遺伝子組み込みを可能にし、AMDまたは他の網膜変性疾患を治療するための細胞ベースの遺伝子付加療法の開発に不可欠な PEDF の継続的な分泌を保証しました。さらに、 ヒトPE細胞へのPEDF トランスポゾンの組み込みプロファイルの分析は、ほぼランダムなゲノム分布を示しました。
Introduction
高齢は神経変性疾患の主なリスクであると説明されています。加齢黄斑変性症(AMD)は、60歳以上の患者に重篤な視力喪失をもたらす多遺伝子性疾患であり、失明と視力障害の4つの最も一般的な原因に属し1 、2040年には2億8,800万人に増加すると予想されています2。絨毛毛細血管と網膜光受容体の間に位置する密集した細胞の単層である網膜色素上皮(RPE)の機能不全は、AMDの病因の一因となります。RPEは、正常な網膜機能に不可欠な複数のタスクを実行し3、 網膜と絨毛毛細血管の構造的完全性を維持するために不可欠なさまざまな成長因子と因子を分泌し、それによって視細胞の生存をサポートし、循環と栄養素の供給の基礎を提供します。
健康な眼では、色素上皮由来因子(PEDF)は血管内皮成長因子(VEGF)の効果のバランスを取り、アポトーシスからニューロンを保護し、内皮細胞の増殖を防ぎ、毛細血管内皮を安定化させます。VEGFとPEDFの比率の変化は、動物モデル4,5、およびAMDおよび増殖性糖尿病網膜症による脈絡膜新生血管(CNV)患者のサンプルで観察された眼の新生血管に関連しています6,7,8,9,10 .強化されたVEGF濃度は、現在の標準治療の目標です。抗VEGF医薬品であるベバシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、そして最近ではブロルシズマブは、CNV患者の約3分の1の視力を改善するか、むしろ症例の90%で視力を安定させます11、12、13。しかし、頻繁に、しばしば毎月の硝子体内注射は、有害事象のリスクを負い14、患者のコンプライアンスを損ない、医療システム15にとって重大な経済的負担を表しています。さらに、一定の割合の患者(2%〜20%)は、抗VEGF療法に反応しないか、または反応が不十分である16,17,18,19。これらの負の付随物は、代替治療、例えば、眼内インプラント、細胞および/または遺伝子治療アプローチの開発を必要とする。
遺伝子治療は、遺伝性疾患および非遺伝性疾患の有望な治療法として進化しており、機能しない遺伝子配列を回復したり、機能不全の遺伝子配列を抑制したりすることを目的としています。原因因子の特定と置換がほとんど不可能な多遺伝子性疾患の場合、戦略は保護因子の継続的な送達を目指しています。AMDの場合、エンドスタチンおよびアンジオスタチン20の安定発現、VEGFアンタゴニスト可溶性FMS様チロシンキナーゼ-1(sFLT-1)21,22、分化の補体調節タンパク質クラスター59(CD59)23またはPEDF 24,25など、様々な相加療法が開発されている。.眼、特に網膜は、密閉された構造、優れたアクセス可能性、小型、および免疫特権により、遺伝子ベースの薬物療法の優れた標的であり、したがって、低治療用量の局所的な送達を可能にし、移植片を拒絶反応の影響を受けにくくします。さらに、眼は非侵襲的なモニタリングを可能にし、網膜は異なるイメージング技術によって検査することができる。
ウイルスベクターは、その高い形質導入効率のために、治療遺伝子を標的細胞に送達するための主要な媒体である。しかしながら、使用されるウイルスベクターに応じて、免疫および炎症反応26、変異原性および発癌性効果27、28、または他の組織における播種29などの異なる有害反応が記載されている。実用的な制限には、制限されたパッケージサイズ30、および臨床グレードロット31,32の製造に関連する困難とコストが含まれます。これらの欠点は、リポ/ポリプレックス、超音波またはエレクトロポレーションを介して転送される非ウイルス性のプラスミドベースのベクターのさらなる開発を促進した。しかしながら、宿主ゲノムへの導入遺伝子のゲノム組み込みは、通常、プラスミドベクターでは促進されず、したがって一過性の発現をもたらす。
トランスポゾンは、ゲノム内での位置を変える天然に存在するDNA断片であり、遺伝子治療に採用されている特性です。能動統合機構により、トランスポゾンベースのベクターシステムは、挿入された導入遺伝子の連続的かつ一定の発現を可能にする。眠れる森の美女(SB)トランスポゾンは、魚33に見られる古代のTc1 /マリナー型トランスポゾンから再構成され、分子進化によってさらに改良され、活性亢進変異体SB100X34をもたらし、さまざまな初代細胞での効率的な転位を可能にし、さまざまな疾患モデル35の表現型補正に使用されました。現在、SBトランスポゾンシステムを用いて13件の臨床試験が開始されています。SB100Xトランスポゾンシステムは、末端反転リピート(TIR)に挟まれた目的の遺伝子からなるトランスポゾンと、トランスポゾンを動員するトランスポザースの2つのコンポーネントで構成されています。細胞へのプラスミドDNA送達に続いて、トランスポザーゼはTIRに結合し、トランスポゾンの切除および細胞のゲノムへの組み込みを触媒します。
私たちは、血管新生AMDの治療のための非ウイルス細胞ベースの相加療法を開発しました。このアプローチは、SB100Xトランスポゾンシステム36,37,38による初代色素上皮(PE)細胞へのPEDF遺伝子のエレクトロポレーションベースの挿入を含む。トランスポザーゼとPEDFの遺伝情報は別々のプラスミドで提供されるため、理想的なSB100X-PEDFトランスポゾン比の調整が可能になります。エレクトロポレーションは、ピペットベースのキャピラリートランスフェクションシステムを使用して行われ、電極間のギャップサイズを最大化し、表面積を最小限に抑えます。この装置は、広範囲の哺乳動物細胞において優れたトランスフェクション速度を達成することが示された39、40、41。小さな電極表面積は、均一な電界を提供し、電気分解42の様々な副作用を低減する。
トランスフェクトされた色素上皮細胞によって分泌されるPEDFの抗血管新生機能は、ヒト臍帯静脈内皮細胞の発芽、遊走、およびアポトーシスを分析する様々なin vitro実験で示された43。さらに、角膜新生血管のウサギモデル44およびCNV43,45,46のラットモデルにおけるPEDFトランスフェクト細胞の移植は、新生血管形成の低下を示した。
ここでは、キャピラリートランスフェクションシステムを用いたSB100Xトランスポゾンシステムを介して初代ヒトRPE細胞にPEDF遺伝子を安定的に挿入するための詳細なプロトコルについて説明します。トランスフェクトした細胞を21日間培養し、その後、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によるPEDF遺伝子発現、およびイムノブロッティングおよび酵素結合免疫吸着アッセイによるPEDFタンパク質分泌の観点から分析しました(ELISA、図1)。
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Protocol
ヒトドナーの目は、ヘルシンキ宣言プロトコルに従ってインフォームドコンセントを取得した後、眼科のアーヘン角膜バンク(アーヘン大学病院)から取得されました。ヒトサンプルの収集と使用の手順は、機関倫理委員会によって承認されています。
1. 初代ヒトRPE細胞の単離
- 滅菌防護服と手袋をレイアウトします。層流の下に滅菌ドレープを置きます。
- 滅菌調製器具およびその他の必要な滅菌機器を層流の下に置きます。
- アイグローブの受け取り、準備の開始、および起こりうる異常を記録します。ドナーの年齢、性別、死因、死亡から除眼までの期間を登録します。
- アイグローブを滅菌ガーゼ湿布に入れ、片手で持ちます。
- メスと非常に細かい先のとがった目のはさみを使用して、辺縁の後方約3.5 mmの円周方向のカットによって、前部を後部セグメントから分離します。
- 後部を下に傾けた後、コリブリ鉗子を使用して硝子体と網膜を慎重に取り除きます。
- まっすぐな虹彩鉗子を使用して、崩壊したRPE /choroidea複合体を慎重に再配置し、その後、湾曲した虹彩鉗子で所定の位置に保持します。
- 後眼カップに、10%ウシ胎児血清(FBS)、80 U / mLペニシリンと80 μg / mLストレプトマイシン(ペン/ストレプトマイシン)、および2.5 μg / mLアムホテリシンB(AmphoB)を添加したダルベッコの改変イーグル培地/ハムのF-12栄養混合物(DMEM / F12)1mLを入れます。
注:ブタまたはウシの目からの初代RPE細胞の単離とは対照的に36,37、後部アイカップを充填してトリプシンでインキュベートする必要はありません。 - RPE細胞を採取するには、網膜色素上皮を視神経から眼縁部に向かって、火で磨いた湾曲したガラス製パスツールピペットで穏やかにブラッシングし、RPE/choroidea複合体をコリブリ鉗子を使用して四肢に固定します。細胞懸濁液をペトリ皿に移す。
- 手順1.8と1.9を繰り返し、ペトリ皿内のすべての細胞を収集します。シングルチャンネルピペット(100-1,000 μL)を使用して上下にピペッティングし、細胞懸濁液を注意深く再懸濁します。
- 各眼球のRPE細胞懸濁液を24ウェル細胞培養プレートの3つのウェルに播種し、FBS、ペン/ストレプト、およびAmphoBを添加したDMEM/F12を1 mLまで充填します。
- コンフルエントに達するまで、95%の空気と5%のCO2 の加湿雰囲気下でRPE細胞培養物を37°Cに維持します。細胞培養培地を週に2回交換してください。
2. 初代ヒトRPE細胞のエレクトロポレーション
- SB100Xトランスポザーゼ/PEDFトランスポゾンプラスミド混合物の調製
- SB100XトランスポザーゼおよびPEDFトランスポゾンプラスミドDNAは、トランスフェクションなどのアプリケーションでの使用に適していることが確認されている通常のプラスミド精製キットを使用して、製造元のプロトコルに従って精製します。
- マイクロボリューム分光光度計を使用してプラスミドDNA含有量を定量し、10 mM Tris-HCl(pH 8.5)で250 ng/μLの濃度に調整します。
- 250 ng/μL SB100X トランスポザーゼプラスミドDNA(例:2.5 μL)の一部と250 ng/μL PEDF トランスポゾンプラスミドDNA(例:40 μL)の16部を混合します。残留プラスミド混合物は-20°Cで保存することができる。
注:プラスミド混合物の凍結および解凍サイクルを複数回繰り返すことは避けてください。 - 29.4 ngのSB100Xトランスポザーゼプラスミドと470.6 ngのPEDFトランスポゾンプラスミドを含むSB100Xトランスポザーゼ/PEDFトランスポゾンプラスミド混合物2 μLを滅菌済みの1.5 mLセーフロックマイクロ遠心チューブに入れます。細胞と混ざるまで氷上に保管してください。
- キャピラリートランスフェクションシステムのセットアップ
注:初代ヒトRPE細胞のエレクトロポレーションは、メーカーのプロトコルに従って10 μLキットを使用してキャピラリートランスフェクションシステムを介して実行されています。このシステムは、トランスフェクションデバイス、トランスフェクションピペット、およびピペットステーションで構成されています。このキットには、10 μLのトランスフェクションチップ、バッファーチューブ、電解バッファーE(バッファーE)、および再懸濁バッファーR(バッファーR)が含まれています。- ピペットステーションをトランスフェクションデバイスに接続します。
- バッファーチューブに3 mLのバッファーEを満たし、カチッという音が聞こえるまでピペットステーションに挿入します。
注意: バッファーチューブのサイド電極がピペットステーションのサイドボールプランジャーに接続されていることを確認してください。 - 初代ヒトRPE細胞のエレクトロポレーションでは、トランスフェクションデバイスで1,100 V(パルス電圧)、20 ms(パルス幅)、2パルス(パルス数)のパルス条件を設定します。
- 培養初代ヒトRPE細胞の調製
- 初代RPE細胞培養物の形状と形態を位相差顕微鏡で文書化します。低倍率の顕微鏡写真では、RPE細胞がコンフルエントで統合された単層に成長していることを実証し、高倍率の顕微鏡写真を使用して、RPE細胞の典型的な石畳の形態を指摘します。
- 細胞培養液を吸引し、1 mL緩衝リン酸生理食塩水(PBS、pH 7.4)で細胞を2回洗浄します。
- 初代ヒトRPE細胞を0.5 mL 0.05%トリプシン-EDTAで37°C、95%空気と5%CO2 の加湿雰囲気中で7〜15分間(最大)トリプシン処理します。細胞剥離を顕微鏡で確認してください。
- FBSを添加した1 mLのDMEM/F12でトリプシン処理を停止します。血球計算盤を使用した細胞計数のために20 μLのアリコートを取ります。RPE細胞懸濁液を106 x g で10分間遠心分離します。
- 20 μLのアリコートを20 μLのトリパンブルー溶液と混合します。血球計算盤の各半分に10 μLをピペットし、位相差顕微鏡下で細胞を計数した。
- 遠心分離後、RPE細胞ペレットを1 mLのPBSに再懸濁します。
- トランスフェクション反応ごとに10,000〜100,000 RPE細胞を採取し、106 x g で10分間遠心分離します。
注:電場印加およびプラスミドDNAの添加によるトランスフェクション反応に加えて、各アプローチには2つの異なる対照培養も含まれます:(1)電界印加なしおよびプラスミドDNAなし。(2)電界印加あり、プラスミドDNAなし。 - 細胞ペレットを11 μLのバッファーRに再懸濁し、2 μLの SB100X トランスポザーゼ/PEDF トランスポゾンプラスミド混合物と混ぜ合わせます(ステップ2.1.4を参照)。
注:バッファーRに再懸濁した後、細胞の生存率とトランスフェクション効率の低下を避けるために、細胞を15分以内に処理する必要があります。 - クランプがピストンの取り付けステムを完全に持ち上げるまで、トランスフェクションピペットのヘッドを10 μLのトランスフェクションチップに挿入します。細胞/プラスミド溶液をトランスフェクションチップに吸い込みます。
注:気泡の発生とトランスフェクションチップへの気泡の吸引は避けてください。 - FBSを添加したDMEM/F12を1 mL、ペン/ストレプトおよびAmphoBを含まないものを、24ウェル細胞培養プレートの必要な数のウェルに入れます。
- エレクトロポレーションプロセス
- トランスフェクションピペットをピペットステーションに置かれたバッファーチューブに挿入します(ステップ2.2.2を参照)。
注:トランスフェクションピペットのメタルヘッドが、ピペットステーション内のボールプランジャーとバッファーチューブに接続されていることを確認してください。 - トランスフェクションデバイスのタッチスクリーンで [開始 ]を押します。電気パルスを印加する前に、バッファーチューブとトランスフェクションピペットが正しく挿入されているかどうかを自動的にチェックします。電気パルスの送達後、 タッチスクリーンにコンプリート が表示されます。
- トランスフェクションピペットをピペットステーションから慎重に取り出し、細胞/プラスミド溶液を細胞培養プレートの準備ウェルにピペッティングして、エレクトロポレーションされた細胞を10 μLトランスフェクションチップから直ちに放出します(ステップ2.3.10を参照)。
- トランスフェクトしたRPE細胞培養物を、95%の空気と5%のCO2の加湿雰囲気下で37°Cに維持します。エレクトロポレーションの3日後に最初の培地交換でペン/StrepとAmphoBを追加します。
- トランスフェクションピペットをピペットステーションに置かれたバッファーチューブに挿入します(ステップ2.2.2を参照)。
3. 初代ヒトRPE細胞をトランスフェクトした解析
- サンプル調製
- 3週間の培養時間の後、最終的に、FBS、Pen/Strep、およびAmphoBを添加した1.0 mL DMEM/F12の規定容量でRPE細胞培養物を24時間規定のインキュベートします。
- 細胞培養上清を採取し、さらに近い時間処理が行われるまで-20°Cで保存するか、熱的に不安定なサンプルと長期保存の場合は-80°Cで保存します。
- トランスフェクトしたRPE細胞培養液を、0.5 mLの0.05%トリプシン-EDTAで、95%の空気と5%のCO2 の加湿雰囲気下で37°Cで10分間トリプシン処理します。
- FBSを添加した1 mLのDMEM/F12でトリプシン処理を停止します。血球計算盤を使用して細胞計数するために少量のアリコートを取ります(ステップ2.3.5を参照)。RPE細胞懸濁液を106 x g で10分間遠心分離します。
- RPEセルペレットは、さらに処理されるまで-80°Cで保管してください。
- ウェスタンブロッティングによるPEDF分泌の評価
注:定性評価のために、細胞培養上清(ステップ3.1.2を参照)は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)およびその後のウェスタンブロッティングによって分析されます。に応じて PEDF 使用するトランスポゾンプラスミドDNAは、上清を異なる方法で処理しなければならない。- 細胞培養上清からのHisタグ付きPEDF融合タンパク質の精製
- ベベルカットチップを使用してサンプルあたり30 μLのニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)スラリーを取り、遠心分離によってNi-NTA樹脂をペレット化します(2,660 x g で30秒間)。
- Ni-NTA樹脂を200 μLの1xインキュベーションバッファー(50 mM NaH 2 PO4、300 mM NaCl、10 mM イミダゾール、pH 8.0)で慎重に再懸濁し、遠心分離(2,660 x gで30秒間)してペレット化します。
- 前の手順を繰り返します。
- Ni-NTA樹脂をサンプルあたり40 μL 4xインキュベーションバッファー(200 mM NaH 2 PO4、1.2M NaCl、40 mMイミダゾール、pH 8.0)で注意深く再懸濁します。
- 900 μLの細胞培養上清を260 μLの4xインキュベーションバッファーおよび55 μLの前処理Ni-NTAスラリーと混合します(ステップ3.2.1.4を参照)。
- 混合物をロッキングシェーカー上で室温で60分間インキュベートする。
- 遠心分離(2660 x g で60秒間)によりNi-NTA樹脂をペレット化します。
- Ni-NTA樹脂を175 μLの1xインキュベーションバッファーとペレット樹脂で遠心分離(2,660 x g で60秒間)で慎重に再懸濁します。
- 前の手順を繰り返します。
- Ni-NTA樹脂を30 μLの溶出バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 8.0)で注意深く再懸濁し、混合物をロッキングシェーカー上で室温で20分間インキュベートします。
- 遠心分離によりNi-NTA樹脂をペレット化します(2,660 x g で30秒間)。
- 上清を注意深く採取し、2x SDSサンプルバッファー47と混合します。
- 混合物を95°Cで5分間加熱し、Ni-NTA精製タンパク質を10%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離します。
- 前述のように、抗ペンタヒス抗体(マウスモノクローナル、1:500)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗マウス抗体(ウサギポリクローナル、1:1,000)を使用してウェスタンブロッティングを実行します36,37。
- タグなしPEDFタンパク質の直接分析
- 15 μLの細胞培養上清を取り、2x SDSサンプルバッファー47と混合します。
- 混合物を95°Cで5分間加熱し、10%SDS-ポリアクリルアミドゲル上でタンパク質を分離します。
- 前述のように、抗ヒトPEDF抗体(ウサギポリクローナル、1:4,000)およびHRP結合抗ウサギ抗体(ヤギポリクローナル、1:2,000)を使用してウェスタンブロッティングを実行します38。
- ELISA法によるPEDF分泌量の定量
- 製造元のプロトコルに従って、ヒトPEDF ELISAキットを使用して細胞培養上清を分析します(ステップ3.1.2を参照)。
- 分泌されたPEDFの量を、各トランスフェクション反応で決定された時間と細胞数に関連付けます(ステップ3.1.4を参照)。
- トランスフェクトRPE細胞における PEDF 遺伝子発現の解析
- 製造元のプロトコルに従って市販のキットを使用して、RPE細胞ペレットから全RNAを単離します(ステップ3.1.5を参照)。
- マイクロボリューム分光光度計を使用してRNA含有量を定量します。
- メーカーのプロトコルに従って、逆転写システムを使用して0.1 μg RNAの逆転写を実行します。
- 前述のようにリアルタイムqPCRを実行します38。
- トランスフェクトRPE細胞における導入遺伝子挿入部位の解析
- 製造元のプロトコルに従って市販のキットを使用して、RPE細胞ペレットからゲノムDNAを単離します(ステップ3.1.5を参照)。
- 微量分光光度計を使用してDNA含有量を定量します。
- 前述のように、計算支援ヘミ特異的PCRスキームを使用して挿入部位ライブラリを生成する38。
- 前述のように計算解析を実行する38。
- 細胞培養上清からのHisタグ付きPEDF融合タンパク質の精製
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Representative Results
初代ヒトRPE細胞の培養とエレクトロポレーション
我々は、動物起源の十分な数の初代RPE細胞の播種が、色素沈着した六角形の細胞の統合された単層への培養および成長を可能にすることを示した36、37、48。タイトジャンクションを形成し、食作用活性を示し、およびインビトロで特異的マーカー遺伝子を発現するそれらの能力48は、インビボでの網膜色素上皮の実質的なタスクを反映しています。ヒトドナーの眼から単離された培養初代RPE細胞も、ドナーの年齢(65.3 ± 9.94 a、最小:49 a、最大:83 a、n = 12)、死後の分離時間(37.3 ± 17.0時間、最小:16時間、最大:68時間、n = 12)、および培養時間(27.6 ± 14.1 d、最小:13 d、 最大:61 d、n = 12)(図2、左パネル)。キャピラリートランスフェクションシステムを使用して初代ヒトRPE細胞に短期間電気パルスを適用しても、上皮形態に悪影響はありませんでした(図2、右パネル)。さまざまな電気的パラメータのテストにより、パルス電圧1,200 V、パルス幅20 msの2つのパルスが、良好で安定したトランスフェクション効率と最大数の生存RPE細胞をもたらすことが明らかになりました(未発表データ)。
SB100Xを介した培養初代ヒトRPE細胞へのPEDF遺伝子の挿入
SB100XトランスポゾンとPEDFトランスポゾンのプラスミドDNA比は、250 ng(0.08 pmol)のSB100Xトランスポザーゼと250 ng(0.052 pmol)のPEDFトランスポゾンから、12.2 ng(0.0039 pmol)のSB100Xトランスポザーゼと487.8 ng(0.1 pmol)のPEDFトランスポゾンまでの範囲でテストしました。 このアプローチにより、29.4 ng(0.0094 pmol)SB100Xトランスポザーゼと470.6 ng(0.098 pmol)のPEDFトランスポゾン、および23.8 ng(0.0076 pmol)と476.2 ng(0.099 pmol)の2つの組み合わせが、最高の転位効率を得たものとして同定されました37。培養初代ヒトRPE細胞では、SB100Xトランスポゾンシステムを用いたPEDF導入遺伝子の送達により、PEDF遺伝子発現およびPEDFタンパク質分泌が継続的に増加した。Hisタグ付き組換えPEDFについて、トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞からの細胞培養培地のウェスタンブロット分析では、500日以上導入遺伝子サイレンシングなしで一定レベルでPEDF分泌が示されました(図3A)。タグなしPEDFの場合、トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞における分泌は、トランスフェクトされていない細胞と比較して有意に増加することも示された38。連続的に実施されたトランスフェクションからの細胞培養培地の代表的なウェスタンブロット分析は、トランスフェクション後21日目に普遍的に高いPEDF分泌率を明確に示し(図3B)、追求した培養では、少なくとも165日間、長期間のPEDF分泌の上昇が証明されました(図3C)。ELISAベースの定量は、トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞において、それぞれの非トランスフェクト対照細胞と比較して、総PEDF分泌量の20倍の増加を示しました(図3D)。この増加は遺伝子発現レベルでも確認され、PEDFの総発現は30倍以上に上昇しました(図3E)。
図1:SB100Xトランスポゾンシステムによる初代ヒトRPE細胞へのPEDF遺伝子のエレクトロポレーションベースの挿入のワークフロー。このスキームは、(A)初代ヒトRPE細胞の単離とその後のコンフルエント単層への培養、(B)SB100XトランスポザースとPEDFトランスポゾンプラスミドDNAの精製、SB100Xトランスポザーゼ/ PEDFの調製を含むエレクトロポレーションプロセスの単一ステップの時系列を説明しています。 トランスポゾンプラスミド混合物、キャピラリートランスフェクションシステムのセットアップ、培養された初代ヒトRPE細胞の調製、エレクトロポレーション、播種、およびトランスフェクトされたRPE細胞の培養、ならびに(c)トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞の分析、細胞培養上清およびトランスフェクトされた細胞サンプルの調製を含む、 PEDF分泌の評価と定量、およびPEDF遺伝子発現の解析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なるドナーの目から単離されたRPE細胞の位相差顕微鏡写真。 ドナー年齢、死後分離時間、エレクトロポレーション適用前の培養時間が異なる初代ヒトRPE細胞の培養(左パネル)、およびキャピラリートランスフェクションシステムを用いて電気パラメータ1,100 V(パルス電圧)、20 ms(パルス幅)、および2パルス(パルス数)に曝露したトランスフェクトヒト初代RPE細胞の培養(右パネル))、石畳のようなパターンで色素細胞のコンフルエント集積単層を示した(スケールバー:500μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:初代ヒトRPE細胞のSB100Xを介したトランスフェクション後のPEDF分泌およびPEDF遺伝子発現。 (A-C)キャピラリートランスフェクションシステムを使用して、29.4 ng(0.0094 pmol)SB100Xトランスポザーゼプラスミドと470.6 ng(0.098 pmol)PEDFトランスポゾンプラスミドの混合物をトランスフェクトした培養初代ヒトRPE細胞におけるPEDF分泌安定性のイムノブロットベースの分析。(a)26歳のドナー(雌、死後分離時間:26時間、エレクトロポレーション前の培養時間:14日)からのRPE細胞をトランスフェクトし、500日以上培養中に維持した。Hisタグ付き組換えPEDF(~48 kDa)を異なる時点で細胞培養培地から精製し、抗ペンタヒス抗体を用いたウェスタンブロッティングで評価しました。(B)タグなし組換えPEDFの場合、53歳のドナーからのRPE細胞(雌、死後分離時間:28時間、トランスフェクション前の培養時間:19日)をプラスミドDNAなしでエレクトロポレーションし(対照培養物#1および#2)、プラスミドDNAを添加して(PEDFトランスフェクト細胞培養物#3〜#7)、培養で21日間維持した。細胞培養上清は精製せず、抗PEDF抗体を用いたイムノブロッティングにより直接解析した。細胞ライセートのウェスタンブロット分析は、対照(培養物#1および#2)およびトランスフェクト細胞(培養物#3および#4)における細胞内PEDFのレベルを示した。同様のタンパク質量の負荷は、GAPDHタンパク質バンドの等しい密度(~36 kDa)によって示されました。(C)長期のPEDF分泌の分析のために、63歳のドナーからのRPE細胞(男性、死後分離時間:26時間、トランスフェクション前の培養時間:15日)を、プラスミドDNAなしで(対照培養物#1および#2)またはプラスミドDNAでエレクトロポレーションし(PEDFトランスフェクト細胞培養物#3)、培養液で少なくとも165日間維持しました。細胞培養培地は精製せず、抗PEDF抗体を用いたイムノブロッティングにより直接分析した。(D)トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞(2サンプル)および非トランスフェクトされたコントロール細胞(4サンプル)における総PEDF分泌量のELISAベースの定量。トランスフェクトされた細胞の分泌を、トランスフェクトされていない細胞の分泌と比較した(*p = 0.0264、ウェルチの補正による対応のないt検定)。(E)トランスフェクトされた初代ヒトRPE細胞における内因性および総(内因性プラス組換え)PEDF遺伝子発現は、発現を1(破線)に設定した非トランスフェクト対照細胞における発現に関連していた。データは箱ひげ図で表示されます(ひげ:最小から最大)。総PEDF遺伝子発現を内因性PEDF遺伝子発現と比較した(有意ではない、ウェルチの補正による対応のないt検定)。タグなし組換えPEDF(B-E)の結果は、SB100XとPEDFのトランスポゾン比が29.4 ng(0.0094 pmol)プラス470.6 ng(0.098 pmol)でトランスフェクトされた最大27人のドナーからの初代RPE細胞のデータセット全体の2つのユニットを表しており、Thumann et al. 201738によって記載されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本プロジェクトでは、遺伝子導入細胞を保護環境の確立と維持のための長期治療薬として使用するために、有効な因子を継続的に過剰発現および分泌する遺伝子改変初代ヒトRPE細胞の非ウイルス産生を目指しています。私たちは、抗血管新生機能と神経保護機能を有する遍在的に発現する多機能タンパク質であるPEDFをコードする遺伝子の導入を確立しました。ここで説明するプロトコルは、 SB100X トランスポゾンシステムを使用して初代ヒトRPE細胞を安定かつ再現性よくトランスフェクションするために使用できます。DNAの送達とRPE細胞への導入は、キュベットの代わりにエレクトロポレーションチャンバーとして特定のチップを使用するピペットベースのキャピラリートランスフェクションシステムを使用して行われます。
その後のトランスフェクションに使用される形態学的によく分化した細胞からなる初代RPE培養物の濃縮は、ヒトドナー(年齢および一般的な健康状態)および眼の受容(細胞分離の死後時間)に関連するいくつかの要因の影響を受けます。新たに単離および播種された初代RPE細胞は、六角形の細胞の単層を発達させるのに少なくとも2週間かかります。原則として、トランスフェクション前にコンフルエントに達するまでにより多くの時間を必要とする細胞培養も、トランスフェクション後に接着と拡散が減速しました。細胞の接着と拡散は、細胞単離またはトランスフェクションプロセス中に損傷を受けたRPE細胞からの遊離色素沈着によっても妨げられます。
SBトランスポゾンシステムは、治療上関連するヌクレオチド配列を様々なタイプの細胞に効率的かつ安全に送達し、その後遺伝子ベースの細胞療法に適用することを可能にする、広く使用されている遺伝ツールです。特に、その強化された変異体SB100Xは、ウイルスベクターと非ウイルスプラスミドDNAの利点を兼ね備えています。統合作用機序は、宿主細胞のゲノムへの発現カセットの安定したゲノム統合を保証し、目的の遺伝子または配列の持続的な発現を可能にする。潜在的な突然変異誘発および発癌のリスクが高い活性転写ユニットに優先的に組み込むレトロウイルスベクターとは対照的に27,28、SBベースの統合プロファイルはランダムです。これは、ヒト細胞49、50、51、52、ならびに初代ラットおよびヒトRPE細胞38、46を含む様々な培養および初代哺乳動物細胞を用いた多数の研究において実証された。さらに、SBトランスポゾンシステムをプラスミドDNAとして適用すると、免疫原性が低下し、製造プロセスが容易になります。
SB100XトランスポザーゼとPEDFトランスジーンの遺伝情報を別々のプラスミドに送達することは、最適なSB100XとPEDFトランスポゾンの比率を正確に調整できるため、重要な側面です。前述のように、SBトランスポゾン系は、過剰のトランスポザーゼ発現に感受性であり、これは転位活性の阻害をもたらす53。また、初代ヒトRPE培養54の選択的トリプシン処理によって精製された自然発生細胞株であるARPE-19細胞、および初代RPE細胞についてもこの効果を観察しました。ここで、SB100XとPEDFトランスポゾンの比率が最大55.6 ng(0.018 pmol)のSB100Xトランスポザーゼと444.4 ng(0.093 pmol)のPEDFトランスポゾンを加えたトランスフェクションの結果、PEDF分泌率が明らかに低下しました37。 理想的なトランスポザースとトランスポゾンの比率は、新しく構築されたすべてのトランスポゾンプラスミドについて決定する必要があります。
非ウイルスプラスミドベースのベクターは、リポ/ポリプレックス、ナノ粒子、レーザー、超音波、またはエレクトロポレーションを介して転写できます。初代PE細胞のリポフェクションベースのトランスフェクションは効率的ではなく、エレクトロポレーションベースの遺伝子導入に切り替えたことはすでに示しています36。エレクトロポレーションは、細胞に短時間の電界を印加することとして定義され、その結果、膜の透過性が増加し、プラスミドDNAが細胞に入ることができる水性細孔が形成されます。一般に、細胞、プラスミドDNA、および伝導バッファーの混合物は、電気パルスを生成するエレクトロポレーション装置に接続された2つの電極間の特定のエレクトロポレーションチャンバーに充填される。このいわゆるバルクエレクトロポレーションセットアップでは、従来のキュベットエレクトロポレーションチャンバーは、セルタイプとエレクトロポレーション反応ごとに使用されるセル数に応じて、距離が可変(0.1〜0.4 mm)の2つの平行なプレート型電極によって特徴付けられます。トランスフェクション効率は良好ですが、pH変化、熱発生、気泡発生、乱流など、さまざまな副作用がトランスフェクション細胞の生存に悪影響を与える可能性があります。キャピラリートランスフェクションシステムは、最小表面積およびそれらの間の最大ギャップサイズを有する電極を有する42 、ならびに特定の再懸濁および電解緩衝液を使用することによって、キュベットベースの副作用を少なくとも軽減する。しかしながら、それらの組成は開示されていない。
バルクエレクトロポレーションのセットアップ内の機能強化により、細胞の生存率が向上したにもかかわらず、特定の割合の細胞への不可逆的な損傷は避けられません。さらに、細胞に組み込まれたプラスミドの量を正確に制御することはできません。小型化されたエレクトロポレーションシステムの最近の開発により、バルクエレクトロポレーションに関連する制限をさらに軽減することにより、さらなる改善が可能になりました。これらの新しいデバイスは、微小電極、マイクロ流体、またはナノ構造に基づいています。それらは、遺伝子治療、再生医療、およびin situ細胞内調査(ChangらおよびShiらによるレビュー)の分野における新しいアプリケーションの視点を提供します。55,56。
私たちは、最初にキュベットベースのシステムを使用して実行され、その後ピペットベースのキャピラリーシステムを使用して確立されたエレクトロポレーションが、色素上皮細胞株ARPE-19と初代PE細胞の両方をトランスフェクションするための適切かつ効率的な方法であることを実証しました36,37,38,57,58。.使用する細胞の種類に応じて、良好なトランスフェクション効率と細胞の生存の両方を可能にするパラメータを適用する適切なエレクトロポレーションプロトコルを定義することが重要です。電界が不十分な場合、細胞の損傷は防ぎますが、トランスフェクション効率は低くなります。電界強度の増加に伴い、トランスフェクション効率の向上が達成されます。ただし、電気的パラメータの上昇は、不可逆的な細胞損傷のために死細胞の割合も高くなります。ARPE-19細胞株では、キャピラリートランスフェクションシステムを使用して、1,350 V、20 ms、および2パルスのエレクトロポレーションパラメータが100%の初期トランスフェクション効率をもたらすことが示されました37。初代RPE細胞のトランスフェクションにこれらのパラメータを適用すると、効率も良好でしたが、1,100 V、20 ms、および2パルスのエレクトロポレーションパラメータと比較して、トランスフェクション後の培養細胞数も減少しました(データ示さず)。したがって、細胞の損傷を防ぎ、より少ないトランスフェクト細胞を受け入れるために、より穏やかなエレクトロポレーションパラメーターを選択することが決定されました。
このアプローチの全体的な目的は、血管新生AMDに苦しむ患者の治療のためのPEDFトランスフェクト細胞の臨床応用にあります。この治療法は、SB100Xトランスポゾンシステムに基づいて、自己色素上皮細胞へのPEDF導入遺伝子のex vivoへの安定的な導入と、それに続くトランスフェクトされた細胞の患者の網膜下腔への移植を含む。したがって、PEDFトランスフェクト細胞が分化形質転換せず、線維芽細胞の形状および増殖挙動を獲得しないようにすることが重要です。トランスフェクトされた細胞がPEDFの持続的かつ一貫した分泌を可能にすることを証明することも重要です。さらに、特定の期間に特定の数の細胞から分泌されるPEDFの正確な量を知ることが重要です。
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Disclosures
Zoltán IvicsとZsuzsanna Izsvákは、SBトランスポゾン技術に関するいくつかの特許の発明者です。
Acknowledgments
この作業は、研究、技術開発、実証のための欧州連合の第7次フレームワークプログラム、助成金契約第305134号によってサポートされました。Zsuzsanna Izsvákは、欧州研究会議、ERC Advanced(ERC-2011-ADG 294742)から資金提供を受けました。著者らは、優れた技術サポートを提供してくれたAnna DobiasとAntje Schiefer(アーヘン大学病院眼科)と、人間のドナーの目を提供してくれたアーヘン角膜銀行(アーヘン大学病院眼科)に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation of primary human RPE cells | |||
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
| Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
| Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
| Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
| Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
| Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
| Electroporation of primary human RPE cells | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
| Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
| 10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
| 1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| 2x SDS Sample Buffer | |||
| 4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
| Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
| Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
| LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
| LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
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