Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Abstract

Il metodo di clonazione golden gate consente il rapido assemblaggio di più geni in qualsiasi disposizione definita dall’utente. Utilizza enzimi di restrizione di tipo IIS che tagliano al di fuori dei loro siti di riconoscimento e creano una breve sporgenza. Questo sistema di clonazione modulare (MoClo) utilizza un flusso di lavoro gerarchico in cui diverse parti del DNA, come promotori, sequenze di codifica (CDS) e terminatori, vengono prima clonate in un vettore di ingresso. Più vettori di ingresso si assemblano quindi in unità di trascrizione. Diverse unità di trascrizione si connettono quindi in un plasmide multi-gene. La strategia di clonazione del Golden Gate è di enorme vantaggio perché consente un assemblaggio senza cicatrici, direzionale e modulare in una reazione a un vaso. Il flusso di lavoro gerarchico consente in genere la facile clonazione di una grande varietà di costrutti multi-gene senza bisogno di sequenziamento oltre i vettori di ingresso. L’uso di abbandoni proteici fluorescenti consente un facile screening visivo. Questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato e dettagliato per l’assemblaggio di plasmidi multi-genico utilizzando il kit di clonazione modulare del lievito (MoClo). Mostriamo risultati ottimali e non ottimali dell’assemblaggio plasmide multi-genico e forniamo una guida per lo screening per le colonie. Questa strategia di clonazione è altamente applicabile per l’ingegneria metabolica del lievito e altre situazioni in cui è richiesta la clonazione plasmide multi-genica.

Introduction

La biologia sintetica mira a progettare sistemi biologici con nuove funzionalità utili per l’industria farmaceutica, agricola e chimica. Assemblare un gran numero di frammenti di DNA in modo ad alta produttività è una tecnologia fondamentale nella biologia sintetica. Un processo così complicato può scomporsi in più livelli con complessità decrescente, un concetto preso in prestito dalle scienze^{ingegneristiche di base 1,2}. In biologia sintetica, i frammenti di DNA di solito si assemblano gerarchicamente in base alla funzionalità: (i) Livello di parte: “parti” si riferisce a frammenti di DNA con una funzione specifica, come un promotore, una sequenza di codifica, un terminatore, un’origine della replicazione; (ii) Livello di unità di trascrizione (TU): un TU è costituito da un promotore, una sequenza di codifica e un terminatore in grado di trascrivere un singolo gene; ( iii) Livello multi-genico: un plasmide multi-gene contiene più UD spesso composte da un’intera via metabolica. Questo assemblaggio gerarchico introdotto dalla comunità BioBrick è il concetto fondamentale per l’assemblaggio di grandi serie di DNA in biologia sintetica³.

Nell’ultimo decennio^4,5,6,7 , la tecnica di^clonazionedel Golden Gate ha facilitato significativamente l’assemblaggio gerarchico del DNA². Molti altri metodi di clonazione in più parti, come Gibson^{cloning 8}, ligation-independent cloning (SLIC)⁹, uracil excision-based cloning (USER)¹⁰, ligase cycling reaction (LCR)¹¹e in vivo recombination (DNA Assembler)^12,13, sono stati sviluppati finora. Ma la clonazione del Golden Gate è un metodo ideale di assemblaggio del DNA perché è indipendente dalle sequenze specifiche del gene, consentendo l’assemblaggio senza cicatrici, direzionali e modulari in una reazione a un vaso. La clonazione di Golden Gate sfrutta enzimi di restrizione di tipo IIS che riconoscono una sequenza non palindromica per creare sporgenze scaglionate al di fuori del sito di^{riconoscimento 2}. Una ligasi si unisce quindi ai frammenti di DNA ricotto per ottenere un assemblaggio in più parti. L’applicazione di questa strategia di clonazione al sistema modulare di clonazione (MoClo) ha permesso l’assemblaggio di un massimo di 10 frammenti di DNA con oltre il 90% di trasformatori schermati contenenti il costrutto^{correttamente assemblato 4}.

Il sistema MoClo offre enormi vantaggi che hanno accelerato il ciclo di progettazione-costruzione-test della biologia sintetica. In primo luogo, le parti intercambiabili consentono alla clonazione combinatoria di testare rapidamente un ampio spazio di parametri. Ad esempio, l’ottimizzazione di un percorso metabolico di solito richiede di pedalare attraverso molti promotori per ogni gene per bilanciare il flusso del percorso. Il sistema MoClo è in grado di gestire facilmente attività di clonazione così impegnative. In secondo luogo, è necessario sequenziare la parte plasmide ma tipicamente non il TU o i plasmidi multi-genici. Nella maggior parte dei casi, lo screening per colonia PCR o la digestione delle restrizioni è sufficiente per la verifica a livello di TU e plasmide multi-gene. Questo perché la clonazione della parte plasmide è l’unico passo che richiede PCR, che spesso introduce mutazioni. In terzo luogo, il sistema MoClo è ideale per la costruzione di percorsi metabolici complessi multi-genico. Infine, a causa degli strapiombi universali, i plasmidi della parte possono essere riutilizzati e condivisi con l’intera comunità della bioingegneria. Attualmente, i kit MoClo sono disponibili per piante^{14,15,5,16,17,}funghi^{6,18,19,20,21,22,}batteri^{7,23,24,25,26,27}e animali^28,29. Recentemente è stata introdotta anche una piattaforma MoClo multi-regno³⁰.

Per Saccharomyces cerevisiae,Lee et^al. Questo kit è disponibile in un comodo formato da 96 po ‘e definisce otto tipi di parti di DNA intercambiabili con una vasta collezione di promotori ben caratterizzati, proteine fluorescenti, terminatori, tag peptidici, marcatori di selezione, origine della replicazione e strumenti di editing del genoma. Questo toolkit permette l’assemblaggio di un massimo di cinque unità di trascrizione in un plasmide multi-gene. Queste caratteristiche sono preziose per l’ingegneria metabolica del lievito, in cui percorsi parziali o interi sono sovrascritti per produrre sostanze chimiche mirate. Utilizzando questo kit, i ricercatori hanno ottimizzato la produzione di geraniolo, linaloolo^31,penicillina^32,acido muconico^33,indaco³⁴e betalain³⁵ nel lievito.

Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per guidare l’uso del toolkit MoClo per generare percorsi multi-genici per l’espressione episomica o genomica. Attraverso l’uso esorato di questo kit, abbiamo scoperto che la misurazione accurata delle concentrazioni di DNA è fondamentale per garantire la distribuzione equimolare di ogni parte nella reazione del Golden Gate. Consigliamo anche la legasi del DNA T4 sulla ligasi del DNA T7 perché la prima funziona meglio con un numero maggiore di strapiombi³⁶. Infine, tutti i siti di riconoscimento interno di BsmBI e BsaI devono essere rimossi o addomesticati prima dell’assemblaggio. In alternativa, si può prendere in considerazione la sintesi di parti per rimuovere più siti interni e ottenere l’ottimizzazione simultanea del codone. Dimostriamo come utilizzare questo toolkit esprimendo una via a cinque geni per la produzione di β-carotene e licopene in S. cerevisiae. Mostriamo inoltre come eliminare il locus ADE2 utilizzando gli strumenti di modifica del genoma di questo kit. Questi esperimenti basati sul colore sono stati selezionati per una facile visualizzazione. Dimostriamo anche come generare proteine di fusione e creare mutazioni di amminoacidi usando la clonazione del Golden Gate.

Protocol

NOTA: Il protocollo di clonazione gerarchica offerto in questo toolkit può essere diviso in tre passaggi principali: 1. Clonazione di plasmidi di parte; 2. Unità di trascrizione della clonazione (TA); 3. Clonazione di plasmidi multi-genici(figura 1). Questo protocollo parte dal design del primer e termina con le applicazioni del plasmide multi-gene clonato. 1. Design primer per la clonazione della parte plasmide (pYTK001): Progettare i primer avanti e …

Representative Results

Qui i risultati di quattro plasmidi multi-genico replicativi per β-carotene (giallo) e licopene (rosso). È stato costruito un plasmide multi-gene integrativo per interrompere il locus ADE2, le cui colonie sono rosse. Clonazione di CDS nel vettore di ingresso (pYTK001)ERG20 è stato amplificato dal genoma del lievito e dai tre geni carotenoidi crtE, crtYB, crtI d…

Discussion

Il kit di clonazione basato su MoClo sviluppato da Lee et al. L’uso di questo kit elimina il collo di bottiglia di clonazione che richiede tempo che spesso esiste per esprimere più geni nel lievito.

Abbiamo testato cinque diverse condizioni per i cicli di digestione / legatura della clonazione del Golden Gate con T4 DNA ligasi. Abbiamo scoperto che 30 cicli di digestione a 37 °C per 5 minuti e legatura a 16 °C per 5 minuti seguiti da una fase finale di digestione a 50 °C per 10 minuti e un…

Materials

0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification