Schnelle Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit modularem Golden Gate Klonen

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine detaillierte, schrittweise Anleitung für die Montage von Multi-Gen-Konstrukten mit dem modularen Klonsystem auf Basis des Golden Gate Klonens bereitzustellen. Es gibt auch Empfehlungen zu kritischen Schritten, um eine optimale Montage auf der Grundlage unserer Erfahrungen zu gewährleisten.

Abstract

Die Golden Gate Klonmethode ermöglicht die schnelle Montage mehrerer Gene in jeder benutzerdefinierten Anordnung. Es verwendet Typ IIS-Restriktionsenzyme, die außerhalb ihrer Erkennungsstellen schneiden und einen kurzen Überhang erzeugen. Dieses modulare Klonsystem (MoClo) verwendet einen hierarchischen Workflow, in dem verschiedene DNA-Teile wie Promotoren, Codierungssequenzen (CDS) und Terminatoren zunächst in einen Eintragsvektor geklont werden. Mehrere Eintragsvektoren werden dann zu Transkriptionseinheiten zusammengesetzt. Mehrere Transkriptionseinheiten verbinden sich dann mit einem Multigen-Plasmid. Die Golden Gate Klonstrategie ist von enormem Vorteil, da sie eine narbenlose, richtungsweisende und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Der hierarchische Workflow ermöglicht in der Regel das einfache Klonen einer Vielzahl von Multigenkonstrukten, ohne dass eine Sequenzierung über Eingabevektoren hinaus erforderlich ist. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinaussetzern ermöglicht ein einfaches visuelles Screening. Diese Arbeit bietet ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die Zusammenstellung von Multi-Gen-Plasmiden mit dem Hefe-Modul-Klonen (MoClo) Kit. Wir zeigen optimale und suboptimale Ergebnisse der Multi-Gen-Plasmid-Montage und bieten eine Anleitung für das Screening auf Kolonien. Diese Klonstrategie ist hochanwendbar für Hefestoffwechseltechnik und andere Situationen, in denen Multi-Gen-Plasmid-Klonen erforderlich ist.

Introduction

Synthetische Biologie zielt darauf ab, biologische Systeme mit neuen Funktionalitäten zu entwickeln, die für die pharmazeutische, landwirtschaftliche und chemische Industrie nützlich sind. Die Zusammenstellung einer großen Anzahl von DNA-Fragmenten auf hochdurchsatzweise ist eine grundlegende Technologie in der synthetischen Biologie. Solch ein komplizierter Prozess kann in mehrere Ebenen mit abnehmender Komplexität zerbrechen, ein Konzept, das aus den grundlegenden Ingenieurwissenschaften^entlehntist 1^,2. In der synthetischen Biologie fügen sich DNA-Fragmente in der Regel hierarchisch auf der Grundlage der Funktionalität zusammen: (i) Bauteilebene: “Teile” bezieht sich auf DNA-Fragmente mit einer bestimmten Funktion, wie z. B. einem Promotor, einer Codierungssequenz, einem Terminator, einem Ursprung der Replikation; ii) Transkriptionseinheiten (TU) Ebene: eine TU besteht aus einem Promotor, einer Kodierungssequenz und einem Terminator, der in der Lage ist, ein einzelnes Gen zu transkribieren; (iii) Multigen-Niveau: Ein Multigen-Plasmid enthält mehrere TUs, die häufig aus einem gesamten Stoffwechselweg bestehen. Diese hierarchische Montage, die von der BioBrick-Community entwickelt wurde, ist das grundlegende Konzept für die Montage großer DNAs-Sets in der Synthetischen Biologie³.

In den letzten zehn Jahren^4,5,6,7, hat die Golden Gate Klontechnik die hierarchische DNA-Montage erheblich erleichtert². Viele andere mehrteilige Klonverfahren, wie Gibson Klonen⁸, ligationsunabhängiges Klonen (SLIC)⁹, uracil Exzision-basiertes Klonen (USER)¹⁰, die Ligase-Cycling-Reaktion (LCR)¹¹und die in vivo-Rekombination (DNA Assembler)^12,13, wurden bisher entwickelt. Aber Golden Gate Klonen ist eine ideale DNA-Montagemethode, da es unabhängig von genspezifischen Sequenzen ist und eine narbenlose, gerichtete und modulare Montage in einer Ein-Topf-Reaktion ermöglicht. Golden Gate Klonen nutzt Typ IIS-Restriktionsenzyme, die eine nicht-palindromische Sequenz erkennen, um gestaffelte Überhänge außerhalb der Erkennungsstelle²zu erzeugen. Ein Ligase schließt sich dann den geglühten DNA-Fragmenten an, um eine mehrteilige Baugruppe zu erhalten. Die Anwendung dieser Klonstrategie auf das modulare Klonsystem (MoClo) hat die Zusammenstellung von bis zu 10 DNA-Fragmenten mit über 90% transformierten Transformationsmitteln ermöglicht, die das richtig montierte Konstrukt⁴enthalten.

Das MoClo-System bietet enorme Vorteile, die den Design-Build-Test-Zyklus der synthetischen Biologie beschleunigt haben. Erstens ermöglichen die austauschbaren Teile das kombinatorische Klonen, um einen großen Parameterraum schnell zu testen. Zum Beispiel erfordert die Optimierung eines Stoffwechselwegs in der Regel radfahren durch viele Promotoren für jedes Gen, um den Pfadfluss auszugleichen. Das MoClo-System kann solche anspruchsvollen Klonaufgaben problemlos bewältigen. Zweitens muss man das Teilplasmid sequenzieren, aber in der Regel nicht die TU oder die Multi-Gen-Plasmide. In den meisten Fällen reicht ein Screening nach Kolonie-PCR oder Restriktionsverdauung für die Überprüfung auf TU- und Multigen-Plasmid-Ebene aus. Dies liegt daran, dass das Klonen des Teilplasmids der einzige Schritt ist, der PCR erfordert, was häufig Mutationen einführt. Drittens ist das MoClo-System ideal für den Aufbau von multigenkomplexen Stoffwechselwegen. Schließlich können die Teilplasmide aufgrund der universellen Überhänge wiederverwendet und mit der gesamten Bioengineering-Community geteilt werden. Derzeit sind MoClo Kits für Pflanzen^{14,15,5,16,17}, Pilze^{6,18,19,20,21,22}, Bakterien^{7,23,24,25,26,27}, und Tiere^28,29. Eine Multi-Königreich MoClo Plattform wurde auch vor kurzem^{eingeführt 30}.

Für Saccharomyces cerevisiaehaben Lee et al.⁶ ein vielseitiges MoClo Toolkit entwickelt, eine ausgezeichnete Ressource für die Gemeinschaft der synthetischen Hefebiologie. Dieses Kit ist in einem praktischen 96-Well-Format erhältlich und definiert acht Arten austauschbarer DNA-Teile mit einer vielfältigen Sammlung von gut charakterisierten Promotoren, fluoreszierenden Proteinen, Terminatoren, Peptid-Tags, Selektionsmarkern, Herkunft der Replikation und Genombearbeitungswerkzeugen. Dieses Toolkit ermöglicht die Zusammenstellung von bis zu fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid. Diese Eigenschaften sind wertvoll für Hefe-Stoffwechsel-Engineering, in dem teilweise oder ganze Wege überexprimiert werden, um gezielte Chemikalien zu produzieren. Mit diesem Kit, Forscher haben die Produktion von Geraniol optimiert, Linalool³¹, Penicillin³², Muconic Säure³³, Indigo³⁴, und Betalain³⁵ in Hefe.

Hier stellen wir ein detailliertes, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung, das die Verwendung des MoClo-Toolkits zur Erzeugung von Multigen-Signalpfaden für episomale oder genomische Expressionen leitet. Durch den umfangreichen Einsatz dieses Kits haben wir festgestellt, dass die genaue Messung von DNA-Konzentrationen der Schlüssel ist, um die Äquimolarverteilung jedes Teils in der Golden Gate-Reaktion sicherzustellen. Wir empfehlen auch die T4 DNA Ligase über die T7 DNA Ligase, weil erstere besser funktioniert mit einer größeren Anzahl von Überhängen³⁶. Schließlich müssen alle internen Erkennungsstellen von BsmBI und BsaI vor der Montage entfernt oder domestiziert werden. Alternativ kann man erwägen, Teile zu synthetisieren, um mehrere interne Sites zu entfernen und gleichzeitige Codon-Optimierung zu erreichen. Wir zeigen, wie dieses Toolkit verwendet wird, indem wir einen Fünf-Gen-Weg für die β-Carotin- und Lycopinproduktion in S. cerevisiae exemiten. Wir zeigen weiter, wie man den ADE2-Lokus mit den Genom-Editing-Tools aus diesem Kit ausschaltet. Diese farbbasierten Experimente wurden für eine einfache Visualisierung ausgewählt. Wir zeigen auch, wie Fusionsproteine erzeugt und Aminosäuremutationen mit Golden Gate Klonen erzeugt werden.

Protocol

HINWEIS: Das hierarchische Klonprotokoll, das in diesem Toolkit angeboten wird, kann in drei Hauptschritte unterteilt werden: 1. Klonen von Teilplasmiden; 2. Klontranskriptionseinheiten (TUs); 3. Klonen von Multigenplasmiden (Abbildung 1). Dieses Protokoll beginnt mit dem Primer-Design und endet mit Anwendungen des geklonten Multi-Gen-Plasmids. 1. Primer-Design zum Klonen des Teilplasmids (pYTK001): Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung…

Representative Results

Hier die Ergebnisse von vier replizierenden Multigenplasmiden zur β-Carotin (gelb) und Lycopin (rot). Es wurde ein integratives Multigen-Plasmid zur Störung des ADE2-Lokus konstruiert, dessen Kolonien rot sind. Klonen von CDS in den Eintragsvektor (pYTK001)ERG20 wurde aus dem Hefegenom und den drei Carotinoidgenen crtE, crtYB, crtI aus dem Plasmid pLM494<sup cla…

Discussion

Das von Lee et al. entwickelte MoClo-basierte Klonkit bietet eine hervorragende Ressource für die schnelle Montage von ein bis fünf Transkriptionseinheiten in ein Multi-Gen-Plasmid, entweder für die Replikation oder Integration in das Hefegenom. Die Verwendung dieses Kits eliminiert den zeitaufwändigen Klonengpass, der häufig für die Exklamierung mehrerer Gene in Hefe besteht.

Wir haben fünf verschiedene Bedingungen für die Verdauungs-/Ligationszyklen des Golden Gate Klonens mit T4 DNA…

Materials

0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification