Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen
Summary
Gemanipuleerde weefsels zijn sterk afhankelijk van de juiste vasculaire netwerken om vitale voedingsstoffen en gassen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. In dit werk creëert een stapsgewijs zaaiprotocol van endotheelcellen en ondersteunende cellen sterk georganiseerde vasculaire netwerken in een platform met hoge doorvoer voor het bestuderen van het ontwikkelen van vesselgedrag in een gecontroleerde 3D-omgeving.
Abstract
Het cardiovasculaire systeem is een belangrijke speler in de menselijke fysiologie en biedt voeding aan de meeste weefsels in het lichaam; vaten zijn aanwezig in verschillende maten, structuren, fenotypes en prestaties, afhankelijk van elk specifiek doordrenkt weefsel. Het gebied van weefseltechniek, dat tot doel heeft beschadigde of ontbrekende lichaamsweefsels te herstellen of te vervangen, vertrouwt op gecontroleerde angiogenese om een goede vascularisatie binnen de gemanipuleerde weefsels te creëren. Zonder een vasculair systeem kunnen dik ontworpen constructies niet voldoende worden gevoed, wat kan leiden tot celdood, slechte engraftment en uiteindelijk falen. Het begrijpen en beheersen van het gedrag van gemanipuleerde bloedvaten is dus een uitstekende uitdaging in het veld. Dit werk presenteert een systeem met hoge doorvoer dat het mogelijk maakt om georganiseerde en herhaalbare scheepsnetwerken te creëren voor het bestuderen van scheepsgedrag in een 3D-steigeromgeving. Dit tweestaps zaaiprotocol laat zien dat vaten binnen het systeem reageren op de steigertopografie en onderscheidend kiemgedrag vertonen, afhankelijk van de geometrie van het compartiment waarin de vaten zich bevinden. De verkregen resultaten en het begrip van dit hoge doorvoersysteem kunnen worden toegepast om betere 3D-bioprinted steigerconstructieontwerpen te informeren, waarbij de fabricage van verschillende 3D-geometrieën niet snel kan worden beoordeeld bij het gebruik van 3D-printen als basis voor cellulaire biologische omgevingen. Bovendien kan het begrip van dit systeem met hoge doorvoer worden gebruikt voor de verbetering van snelle geneesmiddelenscreening, de snelle ontwikkeling van coculturenmodellen en het onderzoek van mechanische stimuli op de vorming van bloedvaten om de kennis van het vasculaire systeem te verdiepen.
Introduction
Het gebied van weefseltechniek vordert snel in de richting van de fabricage van constructies om ontbrekende of beschadigde organen en weefsels te vervangen1. Volledig functionele constructies moeten echter nog worden bereikt, deels omdat het genereren van operationele vasculaire netwerken voor weefselvoeding een uitstekende uitdaging blijft. Zonder de juiste vascularisatie zijn gemanipuleerde weefsels beperkt tot een passief diffusietransport van zuurstof en voedingsstoffen, waardoor de maximale levensvatbare weefseldikte wordt beperkt tot de diffusielimiet, ongeveer 200 μm2. Dergelijke diktes zijn niet geschikt om grote weefseldefecten te herstellen of voor volledige orgaanfabricage, waardoor de aanwezigheid van functioneel vasculair netwerk een verplicht kenmerk is voor functionele en implanteerbare weefsels3.
Het vasculaire systeem bestaat uit een grote verscheidenheid aan bloedvaten, met verschillende groottes, fenotypes en organisatie, nauw verwant aan het gastheerweefsel. Inzicht in het gedrag, de respons en de migratiebeslissingen van de ontwikkelende en ontkiemende vaten kan hun integratie in gemanipuleerde weefsels instrueren4. Momenteel is de meest voorkomende aanpak voor het creëren van in vitro vasculaire netwerken het combineren van endotheelcellen (EC’s) met ondersteunende cellen (SCs, met de mogelijkheid om te differentiëren in muurschilderingscellen), gezaaid in een driedimensionale micro-omgeving. Deze omgeving biedt chemische en fysische aanwijzingen om de cellen in staat te stellen zich te hechten, te verspreiden en zelf te assembleren in scheepsnetwerken2,5,6,7,8. Wanneer ze worden gekweekt, scheiden SCs extracellulaire matrix (ECM) eiwitten af en bieden ze mechanische ondersteuning aan de EC’s, die de buisvormige structuren vormen. Bovendien bevordert een kruisinteractie tussen beide celtypen tubulogenese, het ontkiemen van vaten en migratie, naast de rijping en differentiatie van de SCs in α-gladde spier actine-expresserende (αSMA) mural cellen4. De ontwikkeling van scheepsnetwerk wordt meestal bestudeerd in 3D-omgevingen die zijn gemaakt met behulp van hydrogels, poreuze polymere steigers of een combinatie daarvan. De laatste optie biedt ook een celvriendelijke omgeving en de vereiste mechanische ondersteuning voor zowel de cellen als de ECM9.
Er is veel werk verricht om de vasculaire ontwikkeling te bestuderen, waaronder het co-cultiveren van de cellen op hydrogels10, hydrogels-steigercombinaties11,12, 2D-platforms en microfluïdische apparaten13. Hydrogels kunnen echter gemakkelijk worden vervormd door de door cellen uitgeoefende krachten14, terwijl 2D – en microfluïdische systemen er niet in slagen een dichter bij de natuur gebrachte omgeving te creëren om een meer extrapoleerbare respons te verkrijgen15,16. Inzicht in hoe vormende vaten reageren op hun omgeving kan kritisch inzicht geven dat het mogelijk maakt om ontworpen omgevingen te fabriceren met het vermogen om de ontwikkeling van het schip op een voorspelbare manier te begeleiden. Het begrijpen van vasculaire vormingsverschijnselen is vooral van cruciaal belang om gelijke tred te houden met de snelle opkomst van submicron-tot-micron schaal fabricagetechnieken, zoals stereolithografie, digitale projectielithografie, continue vloeibare interfaceproductie, 3D smelt-elektro jetwriting, oplossingsgebaseerd 3D-elektrojetschrift en opkomende bioprinttechnieken17,18,19,20,21. Het afstemmen van de controle van deze microproductietechnieken met een verdiept begrip van vasculaire biologie is de sleutel tot het creëren van een geschikte ontworpen vasculatuur voor een doelweefsel.
Hier presenteren we een 3D-systeem om de reactie van nieuwe vormende en ontspruitende vaten op de omringende steigergeometrie te bestuderen, waarbij ze hun kiemoorsprong en daaropvolgende migratie observeren22. Door gebruik te maken van 3D-steigers met gemeleerde compartimentgeometrieën en een tweestaps zaaitechniek, slaagden we erin om op een duidelijke en eenvoudig te analyseren manier zeer georganiseerde vasculaire netwerken te creëren. De tessellated geometrieën bieden een systeem met hoge doorvoer met afzonderlijke eenheden met vaten die reageren op hun lokale omgeving. Met behulp van veelkleurige EC’s volgden we de oorsprong van de kiemvorming en de daaropvolgende migratiepatronen, gecorreleerd met de compartimentgeometrie en de SCs-locatie22.
Hoewel het voorgestelde protocol is voorbereid om de effecten van geometrische signalen op vascularisatiegedrag te analyseren, kan deze aanpak worden uitgebreid en toegepast op een verscheidenheid aan nieuwe toepassingen. De tessellated scaffold en de gemakkelijk te beeldbare netwerken maken een eenvoudige analyse van verschillende EC’s en SCs-interactie mogelijk, de toevoeging van specifieke orgaancellen en hun interactie met de vasculaire netwerken, medicijneffect op vasculaire netwerken en meer. Ons voorgestelde systeem resulteert zeer veelzijdig en van eenvoudige fabricage en verwerking.
Protocol
Representative Results
Discussion
De behoefte aan een rijke vasculatuur in ingebed in gemanipuleerde weefsels is van cruciaal belang voor de overleving van de constructie en de juiste functie1. Hoewel engineering van het vasculaire systeem de focus is geweest van een enorme hoeveelheid onderzoek, is er nog veel over om te onderzoeken en te begrijpen24. In het bijzonder moet de microvasculatuur zich bij het recreëren van een specifiek weefsel gedragen en dienovereenkomstig organiseren12</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van de University of Michigan – Israel Partnership for Research. De auteurs willen Uri Merdler, Lior Debbi en Galia Ben David bedanken voor hun grote hulp en steun, Nadine Wang, Ph.D. en Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. van de Lurie Nanofabrication Facility aan de Universiteit van Michigan, evenals Luis Solorio, Ph.D. voor verhelderende discussies over fotolithografietechnieken.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
References
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. 생체공학. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -. H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
