זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים
Summary
רקמות מהונדסות מסתמכות במידה רבה על רשתות כלי דם נאותות כדי לספק חומרים מזינים וגזים חיוניים ולהסיר פסולת מטבולית. בעבודה זו, פרוטוקול זריעה צעד אחר צעד של תאי אנדותל ותאי תמיכה יוצר רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בפלטפורמת תפוקה גבוהה לחקר התנהגות כלי שיט מתפתחת בסביבה תלת-ממדית מבוקרת.
Abstract
מערכת הלב וכלי הדם היא שחקן מפתח בפיזיולוגיה האנושית, מתן הזנה לרוב הרקמות בגוף; כלי שיט נמצאים בגדלים שונים, מבנים, פנוטיפים וביצועים בהתאם לכל רקמה מפוזרת ספציפית. תחום הנדסת הרקמות, שמטרתו לתקן או להחליף רקמות גוף פגומות או חסרות, מסתמך על אנגיוגנזה מבוקרת כדי ליצור כלי דם נאות בתוך הרקמות המהונדסות. ללא מערכת כלי דם, מבנים מהונדסים עבים לא ניתן להזנה מספקת, אשר עלול לגרום למוות תאים, תחריט לקוי, ובסופו של דבר כישלון. לכן, הבנה ושליטה על ההתנהגות של כלי דם מהונדסים היא אתגר יוצא דופן בתחום. עבודה זו מציגה מערכת תפוקה גבוהה המאפשרת יצירת רשתות כלי שיט מאורגנות וחוזרות על עצמן לחקר התנהגות כלי שיט בסביבת פיגומים תלת-ממדית. פרוטוקול זריעה דו-שלבי זה מראה כי כלי שיט בתוך המערכת מגיבים לטופוגרפיית הפיגומים, ומציגים התנהגויות נבטים ייחודיות בהתאם לגיאומטריית התא שבה שוכנים כלי השיט. התוצאות המתקבלות והבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו ניתן ליישם על מנת ליידע טוב יותר 3D ביו מודפס עיצובים מבנה פיגומים, שבו ייצור של גיאומטריות 3D שונות לא ניתן להעריך במהירות בעת שימוש בהדפסה 3D כבסיס לסביבות ביולוגיות תאיות. יתר על כן, ההבנה ממערכת תפוקה גבוהה זו עשויה להיות מנוצלת לשיפור סינון תרופות מהיר, ההתפתחות המהירה של מודלים של תרבויות משותפות, וחקירת גירויים מכניים על היווצרות כלי דם כדי להעמיק את הידע של מערכת כלי הדם.
Introduction
תחום הנדסת הרקמות מתקדם במהירות לקראת ייצור מבנים מהונדסים להחלפת איברים ורקמות חסרים או פגומים1. עם זאת, מבנים מתפקדים במלואם טרם הושגו, בין השאר, שכן יצירת רשתות כלי דם תפעוליות להזנת רקמות נותרה אתגר יוצא מן הכלל. ללא כלי דם נאותים, רקמות מהונדסות מוגבלות להובלת דיפוזיה פסיבית של חמצן וחומרים מזינים, מה שמגביל את עובי הרקמה המקסימלית בת קיימא למגבלת הדיפוזיה, כ -200 מיקרומטר2. עוביים כאלה אינם מתאימים לתיקון פגמים ברקמות גדולות או לייצור איברים מלא, מה שהופך את נוכחותה של רשת כלי דם תפקודית למאפיין חובה לרקמות פונקציונליות ומושתלות3.
מערכת כלי הדם מורכבת ממגוון רחב של כלי דם, בגדלים שונים, פנוטיפים וארגון, הקשורים קשר הדוק לרקמה המארחת. הבנת ההתנהגות, התגובה והחלטות ההגירה המתבצעות על ידי כלי השיט המתפתחים והנבטיים יכולה להורות על שילובם ברקמות מהונדסות4. נכון לעכשיו, הגישה הנפוצה ביותר ליצירת רשתות כלי דם במבחנה היא שילוב תאי אנדותל (ECs) עם תאי תמיכה (SCs, עם היכולת להבדיל לתאי ציור קיר), זרע בתוך מיקרו-סביבה תלת מימדית. סביבה זו מספקת רמזים כימיים ופיזיים כדי לאפשר לתאים לצרף, להתרבות ולהרכיב את עצמם לרשתות כלישיט 2,5,6,7,8. כאשר הם מתרבתים במשותף, SCs מפרישים חלבונים מטריצה חוץ-תאית (ECM) תוך מתן תמיכה מכנית למחשבים האלקטרוניים, היוצרים את המבנים הצינוריים. יתר על כן, אינטראקציה צולבת בין שני סוגי התאים לקדם tubulogenesis, כלי נבט והגירה, בנוסף התבגרות SCs ובידול לתוך α חלקה שריר actin-ביטוי (αSMA) תאים ציורי קיר4. פיתוח רשת כלי השיט נחקר בדרך כלל בסביבות תלת מימדיות שנוצרו באמצעות הידרוג’לים, פיגומים פולימריים נקבוביים, או שילוב שלהם. האפשרות השנייה מספקת באותה מידה סביבה ידידותית לתאים ואת התמיכה המכנית הנדרשת הן עבור התאים והן עבור ECM9.
כמות גדולה של עבודה בוצעה כדי לחקור את התפתחות כלי הדם, כולל שיתוף culturing התאים על הידרוג’לים10, הידרוג’לים-פיגומים שילובים11,12, פלטפורמות 2D, והתקנים microfluidic13. עם זאת, הידרוג’לים יכולים להיות מעוותים בקלות על ידי הכוחות המופעלים על ידי התא14, בעוד מערכות דו-צדדיות ומיקרופלואידיות אינן מצליחות ליצור מחדש סביבה קרובה יותר לטבע כדי להשיג תגובה נוספת15,16. הבנת האופן שבו כלי שיט יוצרים מגיבים לסביבתם יכולה לספק תובנה קריטית שעשויה לאפשר ייצור סביבות מהונדסות עם היכולת להדריך את פיתוח כלי השיט באופן צפוי. הבנת תופעות היווצרות כלי דם היא קריטית במיוחד כדי לשמור על קצב עם הופעתה המהירה של טכניקות ייצור בקנה מידה תת-מיקרון, כגון סטריאוליטוגרפיה, ליתוגרפיה הקרנה דיגיטלית, ייצור ממשק נוזלי מתמשך, 3D להמיס אלקטרו jetwriting, פתרון מבוסס 3D אלקטרו סילון כתיבה, וטכניקות bioprinting המתעוררים17,18,19,20,21. יישור השליטה של טכניקות micromanufacturing אלה עם הבנה מעמיקה של ביולוגיה של כלי הדם הוא המפתח ליצירת כלי דם מהונדס מתאים עבור רקמת היעד.
כאן, אנו מציגים מערכת תלת מימדית כדי לחקור את התגובה של כלי להרכיב ונבטים חדשים לגיאומטריית הפיגומים שמסביב, תוך התבוננות במקור הנבטים שלהם ובנדידההבאה 22. על ידי שימוש בפיגומים תלת-ממדיים עם גיאומטריות תאים עם סלקציה, וטכניקת זריעה דו-שלבית, הצלחנו ליצור רשתות כלי דם מאורגנות מאוד בצורה ברורה וקלה לניתוח. הגיאומטריות הממוקדות מספקות מערכת תפוקה גבוהה עם יחידות בודדות המכילות כלי שיט המגיבים לסביבתם המקומית. באמצעות מחשבים אלקטרוניים צבעוניים, עקבנו אחר מקורות היווצרות נבטים ודפוסי העברה עוקבים, בקורלציה לגיאומטריית התא ולמיקום SCs22.
למרות שהפרוטוקול המוצע הוכן לנתח את ההשפעות של רמזים גיאומטריים על התנהגות כלי הדם, ניתן להרחיב גישה זו וליישם אותה על מגוון יישומים חדשים. הפיגום המוצף והרשתות הניתנות להדפסה בקלות מאפשרים ניתוח פשוט של אינטראקציה בין ECs ו- SCs שונים, תוספת של תאי איברים ספציפיים והאינטראקציה שלהם עם רשתות כלי הדם, השפעת סמים על רשתות כלי דם ועוד. תוצאות המערכת המוצעות שלנו מאוד תכליתי של ייצור ועיבוד פשוטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצורך בכלי דם עשיר בתוך מוטבע ברקמות מהונדסות הוא קריטי לבניית הישרדות ותפקוד תקין1. למרות הנדסת מערכת כלי הדם כבר המוקד של כמות עצומה של מחקר, הרבה נשאר לחקור ולהבין24. בפרט, בעת יצירה מחדש של רקמה ספציפית, microvasculature צריך להתנהג ולארגן בהתאם12. הגישה הנפ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך במימון אוניברסיטת מישיגן – שותפות ישראלית למחקר. המחברים מבקשים להודות לאורי מרדלר, ליאור דבי וגליה בן דוד על עזרתם ותמיכתם הרבה, נדין וואנג, Ph.D. ופילאר הררה-פיירו, Ph.D. של מתקן Nanofabrication לוריא באוניברסיטת מישיגן, כמו גם לואיס Solorio, Ph.D. עבור דיונים מאירי עיניים של טכניקות פוטוליטוגרפיה.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
References
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. 생체공학. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -. H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
