Emplacement, dissection et analyse du ganglion radié murin
Summary
Les changements pathophysiologiques du système nerveux autonome cardiaque, particulièrement dans sa branche sympathique, contribuent au début et à l’entretien des arythmies ventriculaires. Dans le protocole actuel, nous montrons comment caractériser les ganglions radiés murins pour améliorer la compréhension des processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.
Abstract
Le système nerveux autonome est un moteur important de l’électrophysiologie cardiaque. Particulièrement le rôle de sa branche sympathique est une question continue de recherche dans la pathophysiologie des arythmies ventriculaires (VA). Les neurones dans les ganglions étoilés (SG) – structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique – sont une composante importante de l’infrastructure sympathique. Le SG sont une cible identifiée pour le traitement par l’intermédiaire de l’énervation sympathique cardiaque dans les patients présentant le VA thérapie-réfractaire. Tandis que la retouche neuronale et l’activation glial dans le SG ont été décrites dans les patients présentant le VA, les processus cellulaires et moléculaires fondamentaux qui précèdent potentiellement le début de l’arythmie sont seulement insuffisamment compris et devraient être élucisés pour améliorer la modulation autonome. Les modèles murins nous permettent d’étudier le remodelage neuronal sympathique, mais l’identification du SG murin est difficile pour l’investigateur inexpérimenté. Ainsi, les études biologiques cellulaires et moléculaires approfondies du SG murin font défaut pour beaucoup de maladies cardiaques communes. Ici, nous décrivons un répertoire de base pour disséquer et étudier le SG chez les souris adultes pour des analyses au niveau de l’ARN (isolement de l’ARN pour les analyses d’expression génique, hybridation in situ), au niveau des protéines (coloration immunofluorescente de monture entière) et au niveau cellulaire (morphologie de base, mesure de la taille cellulaire). Nous présentons des solutions potentielles pour surmonter des défis dans la technique de préparation, et comment améliorer la souillure par trempe de l’autofluorescence. Cela permet la visualisation des neurones ainsi que des cellules gliales via des marqueurs établis afin de déterminer la composition cellulaire et les processus de remodelage. Les méthodes présentées ici permettent de caractériser le SG pour obtenir davantage d’informations sur le dysfonctionnement autonome chez les souris sujettes à VA et peuvent être complétées par des techniques supplémentaires étudiant les composants neuronaux et glial du système nerveux autonome dans le coeur.
Introduction
Le système nerveux autonome cardiaque est un équilibre étroitement régulé de composants sympathiques, parasympathiques et sensoriels qui permet au cœur de s’adapter aux changements environnementaux avec la réponse physiologique appropriée1,2. Des perturbations dans cet équilibre, par exemple, une augmentation de l’activité sympathique, ont été établies comme un facteur clé pour l’apparition ainsi que le maintien des arythmies ventriculaires (VA)3,4. Par conséquent, la modulation autonome, réalisée par l’intermédiaire de la réduction pharmacologique de l’activité sympathique avec des bêta-bloquants, a été une pierre angulaire dans le traitement des patients avec VA pendant des décennies5,6. Mais malgré les interventions pharmacologiques et à base de cathéter, un nombre pertinent de patients souffre toujours de VA7récurrent.
L’entrée sympathique au cœur est principalement médiée par l’intermédiaire de corps cellulaires neuronaux dans les ganglions étoilés (SG), structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique, qui relaient l’information via de nombreux nerfs intrathoraciques du tronc cérébral au cœur8,9,10. Le nerf germant du SG après blessure est associé à va et à la mort cardiaque subite11,12,soulignant le SG comme cible pour la modulation autonome13,14. Une réduction de l’apport sympathique au coeur peut être réalisée temporairement par injection percutanée d’anesthésiques locaux ou de façon permanente par retrait partiel du SG par thoracoscopie vidéo-assistée15,16. L’énervation sympathique cardiaque présente une option pour des patients présentant le VA thérapie-réfractaire avec des résultats prometteurs14,16,17. Nous avons appris de SG explanted de ces patients que le remodelage neuronal et neurochimique, la neuro-inflammation et l’activation glial sont des cachets du remodelage sympathique qui pourrait contribuer ou aggraver le dysfonctionnement autonome18,19. Pourtant, les processus cellulaires et moléculaires sous-jacents dans ces neurones restent obscurs à ce jour, par exemple, le rôle de la transdifférenciation neuronale dans un phénotype cholinergique20,21. Les études expérimentales présentent des approches nouvelles pour traiter l’AV, par exemple, la réduction de l’activité nerveuse sympathique via l’optogénétique22, mais la caractérisation en profondeur du SG fait encore défaut dans de nombreuses pathologies cardiaques qui vont de pair avec l’AV. Des modèles murins imitant ces pathologies permettent d’étudier le remodelage neuronal qui précède potentiellement l’apparition d’arythmies12,23. Ceux-ci peuvent être complétés par d’autres analyses morphologiques et fonctionnelles pour la caractérisation autonome du coeur et du système nerveux. Dans le protocole actuel, nous fournissons un répertoire de base des méthodes permettant de disséquer et de caractériser le SG murin pour améliorer l’entente de VA.
Protocol
Representative Results
Discussion
La compréhension des processus cellulaires et moléculaires dans les neurones et les cellules gliales du système nerveux sympathique qui précèdent l’apparition de l’AV est d’un grand intérêt, car l’arrêt cardiaque soudain reste la cause de décès la plus fréquente dans le monde5. Par conséquent, dans le manuscrit actuel, nous fournissons un répertoire de base de méthodes pour identifier le SG murin – un élément murin au sein de ce réseau – et effectuer des analyses ulté…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Hartwig Wieboldt pour son excellente assistance technique, et l’installation d’imagerie par microscopie UKE (Umif) du centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf pour avoir fourni des microscopes et un soutien. Cette recherche a été financée par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| 96-well plate | TPP | 92097 | RNAscope |
| Adhesion Slides SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopy |
| Albumin bovine Fraction V receptor grade lyophil. | Serva | 11924.03 | Whole mount staining |
| bisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Donkey anti chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Donkey anti goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey anti rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Drying block 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Whole mount staining |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Whole mount staining |
| Ethanol 99 % denatured with MEK, IPA and Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Whole mount staining |
| Eukitt mounting medium | AppliChem | 253681.0008 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Whole mount staining |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| H2O2 30% (w/w) | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Heparin Sodium 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: 3862340 | Preparation SG |
| High-capacity cDNA reverse transctiption kit | Life technologies | 4368813 | RNA isolation |
| Isoflurane (Forene) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparation SG |
| Mayer's hemalum solution | Merck | 1.09249.0500 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Microscope cover glasses 20×20 mm or smaller | Marienfeld | 0101040 | Whole mount staining |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA isolation |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | RNA isolation |
| Opal 570 Reagent Pack | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 43368 | Whole mount staining |
| Pasteur pipettes, LDPE, unsterile, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco | 18912-014 | Whole mount staining |
| Pinzette Dumont SS Forceps | FineScienceTools | 11203-25 | Preparation SG |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | RNA isolation |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | RNA isolation (optional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | RNAscope |
| Stainless steel beads 7 mm | Qiagen | 69990 | RNA isolation |
| Sudan black B | Roth | 0292.2 | Whole mount staining |
| TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Choline acetyltransferase (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Gene expression analysis |
| TaqMan mastermix | Applied biosystems | 4370074 | Gene Expression analysis |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | RNA isolation |
| Triton X-100 10% solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Whole mount staining |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Wacom bamboo pen | Wacom | CTL-460/K | Cell size measurements |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Whole mount staining |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 633 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
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