Summary

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Published: June 16, 2021
doi:

Summary

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Abstract

Oosit nükleer olgunlaşması ile ilgili olaylar iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, döllenmeye ve totipotency kazanımı için sitoplazmada gerçekleşen moleküler yollar ve süreçler hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşması sırasında, gen ifadesindeki değişiklikler transkripsiyon yerine sadece anne haberci RNA’ların (mRNA’lar) çevirisine ve bozulmasına bağlıdır. Bu nedenle, çeviri programının yürütülmesi, embriyo gelişimini sürdürmek için oosit gelişimsel yeterliliğinin oluşturulmasında kilit bir rol oynar. Bu makale, meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde gerçekleşen maternal mRNA çeviri programını tanımlamaya odaklanılmasının bir parçasıdır. Bu yöntem makalesinde, in vitro oosit olgunlaşması sırasında hedef mRNA’ların çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir strateji sunulmuştur. Burada, bir Ypet muhabiri, ilgi geninin 3′ çevrilmemiş bölgesine (UTR) kaynaştırıldı ve daha sonra enjekte edilen hacmi kontrol etmek için mCherry için poliadenillenmiş mRNA kodlaması ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. Muhabir birikimini ölçmek için zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak, oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde çeviri oranları hesaplanır. Burada, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ UTR muhabiri örnek olarak kullanılarak, oosit izolasyonu ve enjeksiyonu, hızlandırılmış kayıt ve veri analizi protokolleri açıklanmıştır.

Introduction

Tamamen büyümüş bir memeli oosit, döllenmeye ve totipotency kazanımı için hazırlıkta hızlı değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler döllenme sonrası embriyonik gelişimi sürdürmek için gereklidir. Nükleer olgunlaşma ile ilişkili olaylar nispeten iyi tanımlanmış olsa da, oosit sitoplazmasındaki moleküler süreçler ve yollar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşmasının son aşamalarında, oositler transkripsiyonel olarak sessizdir ve gen ekspresyonu tamamen mRNA çevirisi ve bozulmasına bağlıdır1,2. Bu nedenle, gelişimsel yeterlilik için kritik proteinlerin sentezi, oosit büyümesi sırasında daha önce sentezlenen uzun ömürlü mRNA’ların zamanlanmış çevirisi programına dayanır1,3. Meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde yürütülen bu maternal mRNA çevirisi programını tanımlamaya odaklanan bu makale, in vitro meiotik olgunlaşma sırasında hedef maternal mRNA’ların tek oositlerde çevirisinin aktivasyonunu ve baskısını incelemek için bir strateji sunun bir parçası olarak sunulmaktadır.

Bu yöntemde, YPet açık okuma çerçevesi, ilgi dökümünün 3′ UTR’sının yukarı akışında klonlanır. Daha sonra, bu muhabiri kodlayan mRNA’lar, enjekte edilen hacmi kontrol etmek için poliadenillenmiş mRNA’lar kodlama mCherry ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. İn vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak muhabir birikimi ölçülür. Sarı floresan protein (YFP) ve mCherry birikimi bireysel oositlerde kaydedilir ve YFP sinyalleri birlikte enjekte edilen mCherry’nin platolu seviyesi ile düzeltilir. Veri toplama işleminden sonra eğrinin montajla elde edilen eğrinin eğimi hesaplanarak in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı zaman aralıkları için çeviri oranları hesaplanır.

Bu yaklaşım, seçilen endojen mRNA’ların çevirislerindeki değişiklikleri deneysel olarak onaylamak için bir araç sağlar. Ek olarak, bu yöntem, hedef mRNAs4,5,6’nın3′ UTR’sının cis düzenleyici unsurlarını manipüle ederek oosit meiotik olgunlaşma sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurların karakterizasyonunu kolaylaştırır. Poli(A) kuyruk uzunluğunun manipülasyonu ayrıca oositlerde adensilaz / deadenylaz aktivitesi hakkında fikir verir5. Cis etkili elementlerin mutajenisi veya RNA immün önksezisi, konyak RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri incelemek için kullanılabilir6,7. Ek olarak, bu yöntem, azaltılmış oosit kalitesi 8,9,10ile ilişkili modellerde hedef 3′ UTR çevirisini ölçerek oosit gelişimsel yeterliliği için kritik olan çeviri programının temel bileşenlerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem makalesi, 21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded oositlerinin IL-7’nin 3′ UTR’sine kaynaşmış bir Ypet muhabiri ile mikro enjekte edildiği temsili bir deney sunun. Oosit enjeksiyonu, zaman atlamalı kayıt ve veri analizi için kurulum ve protokol açıklanmıştır.

Protocol

Hayvanları içeren deneysel prosedürler, San Francisco’daki Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (an182026 protokolü) tarafından onaylandı. 1. Medyanın hazırlanması Temel oosit toplama ortamını ve oosit olgunlaşma ortamını yapmak için Tablo 1’deaçıklandığı gibi tüm bileşenleri ekleyin. Temel toplama ortamı için pH’ı 7,4 olarak ayarlayın. Hem toplama hem de olgunlaşma ortamı için, kullanım gününde 3 mg/m…

Representative Results

21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded prophase I-arrested oositlerine, IL-7’nin 3′ UTR’sine kaynaşmış Ypet muhabirini kodlayan mRNA ve mRNA kodlama mCherry içeren bir muhabir karışımı enjekte edildi. YFP ve mCherry ifadesi 39 oositte kaydedildi, bunlardan 30’u olgunlaştı ve 9’u prophase I’de negatif kontrol olarak tutuklandı. Üç olgunlaşan oosit, gecikmiş bir GVBD’ye (N=2) sahip oldukları veya kayıt sırasında çanağa taşındıkları için analiz için hariç tutuldu (N=1). Şek…

Discussion

Sunulan yöntem, in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde hedef mRNA’nın aktivasyonunu ve çevirisinin baskısını incelemek için bir stratejiyi açıklar. Oosit-kümülüs hücre iletişimi8,13,bu yöntemi tanımlamak amacıyla oosit tarafından salınan bir sitokin olan IL-7 seçildi. IL-7’nin oosit olgunlaşması8 sırasında giderek daha fazla çevrildiğini ve bu yöntemi kullanarak çevirisel ak…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH R01 GM097165, GM116926 ve Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 tarafından Marco Conti’ye desteklenmiştir. Enrico M. Daldello, Lalor Vakfı’ndan bir burs, Natasja G. J. Costermans ise Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü’nden (NWO) rubicon bursu ile desteklendi.

Materials

Preparation of media
Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra Sigma-Aldrich SIAL-A3311
Cilostamide EMD Millipore 231085
MEM alpha Gibco 12561-056
Minimum Essential Medium Eagle  Sigma-Aldrich M2645
Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered Genesee Scientific Corporation (GenClone) 25-512
Sodium Bicarbonate  JT-Baker 3506-1
Sodium Pyruvate Gibco  11360-070
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry
Agarose Apex Biomedical  20-102QD
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C1389-1G
Choo-Choo Cloning Kit McLab CCK-20
CutSmart Buffer (10x) New England Biolabs B7204
DNA loading dye (6x) Thermo Scientific R0611
dNTP Solution New England Biolabs N0447S
DpnI New England Biolabs R0176
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Fisher SM1333
LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova  Teknova L1010
LB Medium (Capsules) MP Biomedicals 3002-021
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Life Technologies AM1908
MfeI-HF restriction enzyme New England Biolabs R3589
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit Invitrogen AM1344
Phusion High Fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0530
Poly(A) Tailing kit Invitrogen AM1350
QIAprep Spin Miniprep Kit  Qiagen 27106
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
S.O.C. medium Thermo Fisher 15544034
TAE buffer  Apex Biomedical  20-193
Ultrapure Ethidium Bromide Solution Life Technologies 15585011
Oocyte collection
Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA
Calibrated micro-pipettes Drummond Scientific Company 2-000-025 
PMSG- 5000 Mybiosource MBS142665
PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 BD 305111
Syringe 1 ml BD 309659
Oocyte micro-injection
35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated MatTek P35G-0-20-C For time-lapse microscopy
Borosilicate glass with filament Sutter Instrument BF100-78-10
Oil for Embryo Culture Irvine Scientific 9305
Petri Dish Falcon 351006 For micro-injection
Tissue Culture Dish Falcon 353001 For oocyte incubation
VacuTip Holding Capillary Eppendorf 5195000036
Software
Biorender BioRender Preparation of Figure 1S
MetaMorph, version 7.8.13.0  Molecular Devices  For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation 

References

  1. Clarke, H. J. Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis. Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).
  2. Gosden, R., Lee, B. Portrait of an oocyte: our obscure origin. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).
  3. Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. Translational control in the germ line. Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).
  4. Dai, X. -. X., et al. A combinational code for mRNA 3’UTR-mediated translational control in the mouse oocyte. Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).
  5. Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption. Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).
  6. Yang, C. R., et al. The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation. Nature Communications. 11, 1399 (2020).
  7. Chen, J., et al. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes & Development. 25 (7), 755-766 (2011).
  8. Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).
  9. Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes. Development. 146 (8), (2019).
  10. Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence. Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).
  11. Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary. Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).
  12. Shu, Y., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  13. Cheng, Y., et al. Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats. Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).
  14. Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation. Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).
  15. Sha, Q. Q., et al. CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte. The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).
  16. Yartseva, V., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming. Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).
  17. Mašek, T., Valášek, L., Pospíšek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
  18. Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
  19. Martins, J. P. S., et al. DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation. Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).
  20. Yang, Y., et al. Maternal mRNAs with distinct 3′ UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation. Genes & development. 31, 1302-1307 (2017).
  21. Cheng, Z., et al. Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis. Cell. 172 (5), 910-923 (2018).
  22. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  23. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  24. Morgan, M., et al. mRNA 3′ uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome. Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).
  25. Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation. RNA. 26 (3), 324-344 (2020).
  26. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
  27. Chen, J., et al. Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes. Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).

Play Video

Cite This Article
Costermans, N. G. J., Daldello, E. M., Marathe, R. J., Conti, M. Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay. J. Vis. Exp. (172), e62041, doi:10.3791/62041 (2021).

View Video