I denne undersøgelse beskriver vi processen med T-lymfocytisolation fra friske prøver af forkalkede aortaventiler og de analytiske trin i T-cellekloning til karakterisering af de adaptive leukocytundersæt ved hjælp af flowcytometrianalyse.
Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD), en aktiv sygdom proces lige fra mild fortykkelse af ventilen til svær forkalkning, er forbundet med høj dødelighed, på trods af nye terapeutiske muligheder såsom transkateter aortaklappen udskiftning (TAVR).
De komplette veje, der starter med ventil forkalkning og føre til svær aorta stenose forbliver kun delvist forstået. Ved at give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo, assaying af T lymfocytter fra stenotisk ventil væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i udviklingen af forkalkning. Efter kirurgisk excision dissekeres den friske aortaklappen i små stykker, og T-lymfocytterne dyrkes, klones derefter analyseres ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan også fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. Resultaterne fra farvningspanelet kan bruges til at spore ændringer i T-cellekoncentrationer over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande af specifikke T-celleundertyper af interesse. I denne undersøgelse viser vi isoleringen af T-celler, udført på friske forkalkede aortaklappen prøver og trinene til at analysere T-celle kloner ved hjælp af flowcytometri til yderligere at forstå den rolle, adaptive immunitet i CAVD patofysiologi.
Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD) er en af de mest almindelige hjerteklap lidelser, med en tung indvirkning på sundhedspleje. Hyppigheden af aortaklappen udskiftning i de sidste år er steget dramatisk og forventes at stige yderligere, på grund af den voksende ældre befolkning1.
Den underliggende patofysiologi af CAVD er kun delvist kendt, og de nuværende terapeutiske strategier er begrænset til konservative foranstaltninger eller aortaklappen udskiftning, enten gennem kirurgiske eller perkutane procedurer. Til dato kan ingen effektiv medicinsk behandling hindre eller vende CAVD progression og høj dødelighed er forbundet med tidlig symptom-debut, medmindre aortaklappen udskiftning (AVR) udføres2. Hos patienter med svær symptomatisk aortastenose blev den 3-årige symptomfri overlevelse rapporteret så lavt som 20%3. Transcatheter aortaklappen udskiftning (TAVR) repræsenterer en ny mulighed, revolutionerende behandling for høj-risiko patienter, især blandt ældre og har dramatisk reduceret dødeligheden, som var i sig selv høj i denne population4,5,6. På trods af de lovende resultater af TAVR er yderligere forskning nødvendig for at forstå CAVD-patofysiologi for at identificere nye tidlige terapeutiske mål7,8,9.
Tidligere menes at være en passiv, degenerativ proces, CAVD er nu anerkendt som en aktiv progressiv sygdom, karakteriseret ved en osteoblastisk fænotype switch af aortaklappen interstitielle celler10. Denne sygdom indebærer progressiv mineralisering, fibrocalcific ændringer og reduceret motilitet af aortaklappen foldere (sklerose), som i sidste ende hindrer blodgennemstrømningen fører til indsnævring (stenose) af aortaklappen åbning11.
Inflammation betragtes som en nøgleproces i CAVD patofysiologi, svarende til processen med vaskulær åreforkalkning. Endotelskade muliggør aflejring og akkumulering af lipidarter, især oxiderede lipoproteiner i aortaklappen12. Disse oxiderede lipoproteiner fremkalder en inflammatorisk reaktion, da de er cytotoksiske, med den inflammatoriske aktivitet, der fører til mineralisering. Den rolle, som medfødte og adaptive immunitet i CAVD udvikling og sygdom progression er for nylig blevet fremhævet13. Aktivering og klonisk udvidelse af specifikke delmængder af hukommelse T-celler er dokumenteret hos patienter med CAVD og mineraliserede aortaklappens foldere, således at inflammatoriske processer antages at være involveret i det mindste i udviklingen af CAVD og formodentlig også i sygdomsprogression14. Faktisk, selv om antigen-præsentere celler og makrofager er til stede i både den sunde og syge ventil, tilstedeværelsen af T-lymfocytter er tegn på en alderen og syge aortaklappen. Denne lymfocytiske infiltrere sammen med en stigning i neovascularization og metaplasi er karakteristiske histologiske tegn på CAVD15.
Vi hypoteser eksistensen af en interaktion mellem aortaklappen interstitielle celler og aktivering af immunsystemet, som potentielt udløser indledningen af en kronisk inflammatorisk proces i aortaklappen. Analysen af T-celler fra stenotisk aortaklappen væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i forkalkning udvikling, da det kan give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo. I det nuværende arbejde, ved hjælp af aortaklappen væv, isolerer vi T-lymfocytter, kultur og kloner dem og karakteriserer dem efterfølgende ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Friske aortaklappen prøver blev fjernet fra CAVD patienter, der fik kirurgisk ventil udskiftning for svær aorta stenose. Efter den kirurgiske excision blev den friske ventilprøve dissekeret i små stykker, og T-cellerne blev kultiveret, klonet derefter analyseret ved hjælp af flowcytometri. Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. De data, der genereres fra farvningspanelet, kan bruges til at spore ændringer i T-lymfocytfordelingen over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande for specifikke T-celleundersæt af interesse.
Udvinding af forkalket væv, isolering af leukocytter fra forkalket væv og især brugen af flowcytometri på denne type væv kan være udfordrende på grund af problemer som autofluorescence. Der findes kun få publikationer med protokoller til dette specifikke formål16,17,18. Heri præsenterer vi en protokol designet specielt til direkte isolation og kultur af T lymfocyt fra humane aortaklappen prøver. Kloniske udvidelse af lymfocytter er et kendetegn for adaptiv immunitet. Undersøgelse af denne proces in vitro giver indsigtsfulde oplysninger om niveauet af lymfocyt heterogenitet19. Efter en tre-ugers inkubationsperiode er T-celleklo klonerne klar til at blive forplantet, da der blev opnået en passende mængde T-celler fra hver klon, så den fænotypiske og funktionelle undersøgelse blev tilladt. Efterfølgende studeres fænotypen af T-kloner af cytofluorometri.
Denne immunologiske protokol er en tilpasning af en metode, der tidligere er udviklet af Amedei et al. til T-celleisolation og karakterisering fra humant væv, specielt designet til forkalket humant væv, såsom i CAVD20,21,22. Protokollen her for isolering af PBMCs (perifere blod mononukleare celler) ved hjælp af bestrålet buffy pels beskriver en effektiv måde at opnå feeder celler (FC), specielt justeret for kloning fase af T lymfocytter isoleret fra ventil interstitielle celler. Fødelaget består af vækstarresterede celler, som stadig er levedygtige og bioaktive. Fødecellernes rolle er vigtig for at understøtte in vitro-overlevelse og vækst af T-lymfocytter isoleret fra ventilinterstitielle celler23. For at undgå spredning af fødeceller i kulturen skal disse celler gennemgå en vækstarrest. Dette kan opnås på to måder: gennem fysiske metoder såsom bestråling eller gennem behandling med cytotoksiske kemikalier, såsom mitomycin C (MMC), et antitumoralt antibiotikum, der kan anvendes direkte på kulturoverfladen24. Her viser vi feeder cellevækst anholdelse opnået gennem celle bestråling.
Denne metode præsenterer en effektiv, omkostningseffektiv måde at isolere og karakterisere T-celler fra aortaklappen væv, der bidrager til at udvide spektret af immunologiske metoder til at udforske CAVD patofysiologi.
Her præsenterer vi en metode til at karakterisere T lymfocyt subpopulationer isoleret fra stenotiske aortaklappen prøver, ved hjælp af flow cytometri. Denne metode kræver brug af bestrålet buffycoat til at isolere PBMCs. Strålingsfrekvensen, som buffy coat poser skal udsættes for, er 9000 Rad/90 Gray (Gy), og det repræsenterer et afgørende skridt til at standse spredningen af feeder celler. Cellernes rolle isoleret fra buffy coat poser er kun at fungere som feeder celler og give næringsstoffer til T-celler isol…
The authors have nothing to disclose.
Alle de buffy frakkeposer, der blev brugt til denne protokol, blev bestrålet takket være tilgængeligheden af Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer og hele holdet af Radiology Department of Charité Benjamin Franklin. Scholarship Holder / Mary Roxana Christopher, dette arbejde er støttet af et stipendium fra det tyske hjerteselskab (DGK).
50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |