Onderzoek naar aortaklepverkalking via isolatie en kweek van T-lymfocyten met behulp van feedercellen van bestraalde buffy coat

Summary

In deze studie beschrijven we het proces van T-lymfocytenisolatie uit verse monsters van verkalkte aortakleppen en de analytische stappen van T-celklonen voor de karakterisering van de adaptieve leukocytensubsets met behulp van flowcytometrie-analyse.

Abstract

Calcific aortaklepziekte (CAVD), een actief ziekteproces variërend van milde verdikking van de klep tot ernstige verkalking, wordt geassocieerd met hoge mortaliteit, ondanks nieuwe therapeutische opties zoals transkatheter aortaklepvervanging (TAVR).

De volledige routes die beginnen met klepverkalking en leiden tot ernstige aortastenose blijven slechts gedeeltelijk begrepen. Door een nauwe weergave van de aortaklepcellen in vivo te bieden, zou het testen van T-lymfocyten uit stenotisch klepweefsel een efficiënte manier kunnen zijn om hun rol in de ontwikkeling van verkalking te verduidelijken. Na chirurgische excisie wordt het verse aortaklepmonster in kleine stukjes ontleed en worden de T-lymfocyten gekweekt, gekloond en vervolgens geanalyseerd met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).

De kleuringsprocedure is eenvoudig en de gekleurde buizen kunnen ook worden bevestigd met 0,5% paraformaldehyde en tot 15 dagen later worden geanalyseerd. De resultaten van het kleuringspaneel kunnen worden gebruikt om veranderingen in T-celconcentraties in de loop van de tijd te volgen in relatie tot interventie en kunnen gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activeringstoestanden van specifieke T-celsubtypen van belang te beoordelen. In deze studie tonen we de isolatie van T-cellen, uitgevoerd op verse verkalkte aortaklepmonsters en de stappen van het analyseren van T-celklonen met behulp van flowcytometrie om de rol van adaptieve immuniteit in CAVD-pathofysiologie verder te begrijpen.

Introduction

Calcific aortaklepziekte (CAVD) is een van de meest voorkomende hartklepaandoeningen, met een zware impact op de gezondheidszorg. De frequentie van aortaklepvervanging is de laatste jaren dramatisch toegenomen en zal naar verwachting verder toenemen, als gevolg van de groeiende oudere ^bevolking1.

De onderliggende pathofysiologie van CAVD is slechts gedeeltelijk bekend en de huidige therapeutische strategieën zijn beperkt tot conservatieve maatregelen of aortaklepvervanging, hetzij door chirurgische of percutane procedures. Tot op heden kan geen enkele effectieve medische behandeling de progressie van CAVD belemmeren of omkeren en is hoge mortaliteit geassocieerd met vroege symptoom-aanvang, tenzij aortaklepvervanging (AVR) wordt ^uitgevoerd2. Bij patiënten met ernstige symptomatische aortastenose werd de 3-jaars symptoomvrije overleving gerapporteerd zo laag als 20%³. Transkatheter aortaklepvervanging (TAVR) vertegenwoordigt een nieuwe optie, die een revolutie teweegbrengt in de behandeling van patiënten met een hoog risico, vooral bij ouderen, en heeft de mortaliteit, die intrinsiek hoog was in deze populatie^{, drastisch verminderd4,5,6}. Ondanks de veelbelovende resultaten van TAVR is verder onderzoek nodig om de PATHOfysiologie van CAVD te begrijpen om nieuwe vroege therapeutische doelen te ^{identificeren7,8,9}.

Eerder gedacht dat het een passief, degeneratief proces was, wordt CAVD nu erkend als een actieve progressieve ziekte, gekenmerkt door een osteoblastische fenotypeschakelaar van de interstitiële cellen van de aortaklep10. Deze ziekte omvat progressieve mineralisatie, fibrocalcische veranderingen en verminderde beweeglijkheid van de aortaklepblaadjes (sclerose), die uiteindelijk de bloedstroom belemmeren, wat leidt tot vernauwing (stenose) van de aortaklepopening11.

Ontsteking wordt beschouwd als een belangrijk proces in cavd pathofysiologie, vergelijkbaar met het proces van vasculaire atherosclerose. Endotheelbeschadiging maakt de afzetting en accumulatie van lipidesoorten mogelijk, met name geoxideerde lipoproteïnen in de ^aortaklep12. Deze geoxideerde lipoproteïnen veroorzaken een ontstekingsreactie, omdat ze cytotoxisch zijn, waarbij de ontstekingsactiviteit leidt tot mineralisatie. De rol van aangeboren en adaptieve immuniteit in de ontwikkeling van CAVD en ziekteprogressie is onlangs ^benadrukt13. De activering en klonale expansie van specifieke subsets van geheugen T-cellen zijn gedocumenteerd bij patiënten met CAVD en gemineraliseerde aortaklepblaadjes, zodat ontstekingsprocessen worden verondersteld op zijn minst betrokken te zijn bij de ontwikkeling van CAVD en vermoedelijk ook bij ^{ziekteprogressie14}. Hoewel antigeen-presenterende cellen en macrofagen aanwezig zijn in zowel de gezonde als de zieke klep, is de aanwezigheid van T-lymfocyten indicatief voor een verouderde en zieke aortaklep. Dit lymfocytische infiltraat samen met een toename van neovascularisatie en metaplasie zijn karakteristieke histologische tekenen van ^CAVD15.

We veronderstellen het bestaan van een interactie tussen de interstitiële cellen van de aortaklep en de activering van het immuunsysteem, wat mogelijk de initiatie van een chronisch ontstekingsproces in de aortaklep veroorzaakt. Het testen van T-cellen uit stenotisch aortaklepweefsel zou een efficiënte manier kunnen zijn om hun rol in de ontwikkeling van verkalking te verduidelijken, omdat het een nauwe weergave van de aortaklepcellen in vivo kan bieden. In het huidige werk, met behulp van aortaklepweefsel, isoleren we T-lymfocyten, kweken en klonen ze, en karakteriseren ze vervolgens met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Verse aortaklepmonsters werden weggesneden van CAVD-patiënten die chirurgische klepvervanging kregen voor ernstige aortastenose. Na de chirurgische excisie werd het verse klepmonster in kleine stukjes ontleed en werden de T-cellen gekweekt, gekloond en vervolgens geanalyseerd met behulp van flowcytometrie. De kleuringsprocedure is eenvoudig en de gekleurde buizen kunnen worden bevestigd met 0,5% paraformaldehyde en tot 15 dagen later worden geanalyseerd. De gegevens die door het kleuringspaneel worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om veranderingen in de distributie van T-lymfocyten in de loop van de tijd in relatie tot interventie te volgen en kunnen gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activeringstoestanden van specifieke T-celsubsets van belang te beoordelen.

De extractie van verkalkt weefsel, de isolatie van leukocyten uit verkalkt weefsel en met name het gebruik van flowcytometrie op dit type weefsel kan een uitdaging zijn, vanwege problemen zoals autofluorescentie. Er bestaan weinig publicaties met protocollen voor dit specifieke doel16,17,18. Hierin presenteren we een protocol dat speciaal is ontworpen voor de directe isolatie en kweek van T-lymfocyten uit menselijke aortaklepmonsters. Klonale expansie van lymfocyten is een kenmerk van adaptieve immuniteit. Het bestuderen van dit proces in vitro levert inzichtelijke informatie op over het niveau van lymfocyten ^{heterogeniteit19}. Na een incubatietijd van drie weken zijn de T-celklonen klaar om te worden geëxplanteerd, omdat een voldoende hoeveelheid T-cellen van elke kloon werd verkregen, om de fenotypische en functionele studie mogelijk te maken. Vervolgens wordt het fenotype van T-klonen bestudeerd door cytofluorometrie.

Dit immunologische protocol is een aanpassing van een eerder door Amedei et al. ontwikkelde methode voor T-celisolatie en karakterisering uit menselijk weefsel, speciaal ontworpen voor verkalkt menselijk weefsel, zoals in CAVD20,21,22. Het protocol hier voor de isolatie van PBMC’s (perifere bloedmononucleaire cellen) met behulp van bestraalde buffy coat beschrijft een effectieve manier om feedercellen (FC) te verkrijgen, specifiek aangepast voor de kloonfase van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële cellen. De feederlaag bestaat uit in groei gestopte cellen, die nog levensvatbaar en bioactief zijn. De rol van feedercellen is belangrijk ter ondersteuning van in vitro overleving en groei van T-lymfocyten geïsoleerd uit klepinterstitiële ^cellen23. Om feedercelproliferatie in cultuur te voorkomen, moeten deze cellen een groeistop ondergaan. Dit kan op twee manieren worden bereikt: door fysische methoden zoals bestraling, of door behandeling met cytotoxische chemicaliën, zoals mitomycine C (MMC), een antitumoraal antibioticum dat rechtstreeks op het kweekoppervlak kan worden ^{aangebracht24}. Hier laten we zien dat de groei van de feedercel wordt gestopt door celbestraling.

Deze methode biedt een efficiënte, kosteneffectieve manier om T-cellen uit aortaklepweefsel te isoleren en te karakteriseren, wat bijdraagt aan het verbreden van het spectrum van immunologische methoden voor het verkennen van CAVD-pathofysiologie.

Protocol

De studie werd uitgevoerd volgens het Statuut van de Charité voor het waarborgen van goede wetenschappelijke praktijken en de wettelijke richtlijnen en bepalingen inzake privacy en ethiek werden gerespecteerd. De ethische commissie keurde alle menselijke experimenten goed en de privacy en anonimiteit van de patiënten werden gehandhaafd in overeenstemming met de regels die op het ethische formulier werden gerapporteerd. OPMERKING: Voor het hieronder beschreven protocol werden verse menselijke…

Representative Results

We gebruikten een eenvoudige en kosteneffectieve methode om de leukocytenpopulatie van verse aortaklepmonsters afgeleid van menselijke patiënten met ernstige aortaklepstenose te karakteriseren (zie protocol). De methode voor het isoleren van PBMC’s is een essentiële stap in het verkrijgen van feedercellen, die in elke stap van het experiment worden gebruikt (kloon-, refeeding- en splitfasen) en die de detectie en karakterisering van infiltrerende leukocyten in aortaklepmonsters mogelijk maken. De belangrijkste stappen …

Discussion

Hier presenteren we een methode om T-lymfocytensubpopulaties te karakteriseren die zijn geïsoleerd uit stenotische aortaklepmonsters, met behulp van flowcytometrie. Deze methode vereist het gebruik van bestraalde buffy coat om de PBMC’s te isoleren. De stralingsfrequentie waaraan de buffy coat bags moeten worden blootgesteld is 9000 Rad/90 Gray (Gy) en het is een cruciale stap om de proliferatie van de feedercellen te stoppen. De rol van de cellen geïsoleerd uit de buffy coat bags is om alleen te fungeren als feeder ce…

Materials

50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801