Undersøgelse af aortaklappen Forkalkning via isolation og kultur af T-lymfocytter ved hjælp af feederceller fra bestrålet Buffy Coat

Summary

I denne undersøgelse beskriver vi processen med T-lymfocytisolation fra friske prøver af forkalkede aortaventiler og de analytiske trin i T-cellekloning til karakterisering af de adaptive leukocytundersæt ved hjælp af flowcytometrianalyse.

Abstract

Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD), en aktiv sygdom proces lige fra mild fortykkelse af ventilen til svær forkalkning, er forbundet med høj dødelighed, på trods af nye terapeutiske muligheder såsom transkateter aortaklappen udskiftning (TAVR).

De komplette veje, der starter med ventil forkalkning og føre til svær aorta stenose forbliver kun delvist forstået. Ved at give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo, assaying af T lymfocytter fra stenotisk ventil væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i udviklingen af forkalkning. Efter kirurgisk excision dissekeres den friske aortaklappen i små stykker, og T-lymfocytterne dyrkes, klones derefter analyseres ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).

Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan også fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. Resultaterne fra farvningspanelet kan bruges til at spore ændringer i T-cellekoncentrationer over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande af specifikke T-celleundertyper af interesse. I denne undersøgelse viser vi isoleringen af T-celler, udført på friske forkalkede aortaklappen prøver og trinene til at analysere T-celle kloner ved hjælp af flowcytometri til yderligere at forstå den rolle, adaptive immunitet i CAVD patofysiologi.

Introduction

Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD) er en af de mest almindelige hjerteklap lidelser, med en tung indvirkning på sundhedspleje. Hyppigheden af aortaklappen udskiftning i de sidste år er steget dramatisk og forventes at stige yderligere, på grund af den voksende ældre ^befolkning1.

Den underliggende patofysiologi af CAVD er kun delvist kendt, og de nuværende terapeutiske strategier er begrænset til konservative foranstaltninger eller aortaklappen udskiftning, enten gennem kirurgiske eller perkutane procedurer. Til dato kan ingen effektiv medicinsk behandling hindre eller vende CAVD progression og høj dødelighed er forbundet med tidlig symptom-debut, medmindre aortaklappen udskiftning (AVR) ^udføres2. Hos patienter med svær symptomatisk aortastenose blev den 3-årige symptomfri overlevelse rapporteret så lavt som 20%³. Transcatheter aortaklappen udskiftning (TAVR) repræsenterer en ny mulighed, revolutionerende behandling for høj-risiko patienter, især blandt ældre og har dramatisk reduceret dødeligheden, som var i sig selv høj i denne ^{population4,5,6}. På trods af de lovende resultater af TAVR er yderligere forskning nødvendig for at forstå CAVD-patofysiologi for at identificere nye tidlige terapeutiske ^mål7,8,9.

Tidligere menes at være en passiv, degenerativ proces, CAVD er nu anerkendt som en aktiv progressiv sygdom, karakteriseret ved en osteoblastisk fænotype switch af aortaklappen interstitielle ^celler10. Denne sygdom indebærer progressiv mineralisering, fibrocalcific ændringer og reduceret motilitet af aortaklappen foldere (sklerose), som i sidste ende hindrer blodgennemstrømningen fører til indsnævring (stenose) af aortaklappen ^åbning11.

Inflammation betragtes som en nøgleproces i CAVD patofysiologi, svarende til processen med vaskulær åreforkalkning. Endotelskade muliggør aflejring og akkumulering af lipidarter, især oxiderede lipoproteiner i aortaklappen12. Disse oxiderede lipoproteiner fremkalder en inflammatorisk reaktion, da de er cytotoksiske, med den inflammatoriske aktivitet, der fører til mineralisering. Den rolle, som medfødte og adaptive immunitet i CAVD udvikling og sygdom progression er for nylig blevet ^fremhævet13. Aktivering og klonisk udvidelse af specifikke delmængder af hukommelse T-celler er dokumenteret hos patienter med CAVD og mineraliserede aortaklappens foldere, således at inflammatoriske processer antages at være involveret i det mindste i udviklingen af CAVD og formodentlig også i ^{sygdomsprogression14}. Faktisk, selv om antigen-præsentere celler og makrofager er til stede i både den sunde og syge ventil, tilstedeværelsen af T-lymfocytter er tegn på en alderen og syge aortaklappen. Denne lymfocytiske infiltrere sammen med en stigning i neovascularization og metaplasi er karakteristiske histologiske tegn på ^CAVD15.

Vi hypoteser eksistensen af en interaktion mellem aortaklappen interstitielle celler og aktivering af immunsystemet, som potentielt udløser indledningen af en kronisk inflammatorisk proces i aortaklappen. Analysen af T-celler fra stenotisk aortaklappen væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i forkalkning udvikling, da det kan give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo. I det nuværende arbejde, ved hjælp af aortaklappen væv, isolerer vi T-lymfocytter, kultur og kloner dem og karakteriserer dem efterfølgende ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Friske aortaklappen prøver blev fjernet fra CAVD patienter, der fik kirurgisk ventil udskiftning for svær aorta stenose. Efter den kirurgiske excision blev den friske ventilprøve dissekeret i små stykker, og T-cellerne blev kultiveret, klonet derefter analyseret ved hjælp af flowcytometri. Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. De data, der genereres fra farvningspanelet, kan bruges til at spore ændringer i T-lymfocytfordelingen over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande for specifikke T-celleundersæt af interesse.

Udvinding af forkalket væv, isolering af leukocytter fra forkalket væv og især brugen af flowcytometri på denne type væv kan være udfordrende på grund af problemer som autofluorescence. Der findes kun få publikationer med protokoller til dette specifikke formål16,17,18. Heri præsenterer vi en protokol designet specielt til direkte isolation og kultur af T lymfocyt fra humane aortaklappen prøver. Kloniske udvidelse af lymfocytter er et kendetegn for adaptiv immunitet. Undersøgelse af denne proces in vitro giver indsigtsfulde oplysninger om niveauet af lymfocyt ^{heterogenitet19}. Efter en tre-ugers inkubationsperiode er T-celleklo klonerne klar til at blive forplantet, da der blev opnået en passende mængde T-celler fra hver klon, så den fænotypiske og funktionelle undersøgelse blev tilladt. Efterfølgende studeres fænotypen af T-kloner af cytofluorometri.

Denne immunologiske protokol er en tilpasning af en metode, der tidligere er udviklet af Amedei et al. til T-celleisolation og karakterisering fra humant væv, specielt designet til forkalket humant væv, såsom i CAVD20,21,22. Protokollen her for isolering af PBMCs (perifere blod mononukleare celler) ved hjælp af bestrålet buffy pels beskriver en effektiv måde at opnå feeder celler (FC), specielt justeret for kloning fase af T lymfocytter isoleret fra ventil interstitielle celler. Fødelaget består af vækstarresterede celler, som stadig er levedygtige og bioaktive. Fødecellernes rolle er vigtig for at understøtte in vitro-overlevelse og vækst af T-lymfocytter isoleret fra ventilinterstitielle ^celler23. For at undgå spredning af fødeceller i kulturen skal disse celler gennemgå en vækstarrest. Dette kan opnås på to måder: gennem fysiske metoder såsom bestråling eller gennem behandling med cytotoksiske kemikalier, såsom mitomycin C (MMC), et antitumoralt antibiotikum, der kan anvendes direkte på ^{kulturoverfladen24}. Her viser vi feeder cellevækst anholdelse opnået gennem celle bestråling.

Denne metode præsenterer en effektiv, omkostningseffektiv måde at isolere og karakterisere T-celler fra aortaklappen væv, der bidrager til at udvide spektret af immunologiske metoder til at udforske CAVD patofysiologi.

Protocol

Undersøgelsen blev gennemført i henhold til statutten for Charité for Sikring af god videnskabelig praksis, og de juridiske retningslinjer og bestemmelser om privatlivets fred og etik blev overholdt. Den etiske komité godkendte alle menneskelige eksperimenter, og patienternes privatliv og anonymitet blev opretholdt i overensstemmelse med de regler, der er rapporteret på etikformularen. BEMÆRK: For den protokol, der er beskrevet nedenfor, blev der anvendt friske humane stenotiske ventilpr…

Representative Results

Vi brugte en enkel og omkostningseffektiv metode til at karakterisere leukocytpopulationen af friske aortaklappenprøver fra humane patienter med svær aortaklappen stenose (se protokollen). Metoden til isolering af PBMCs er et vigtigt skridt i at opnå feederceller, som bruges i hvert trin i eksperimentet (kloning, genfeeding og opdelingsfaser) og muliggør påvisning og karakterisering af infiltrerende leukocytter i aortaklappenprøver. De vigtigste trin i denne metode er vist i figur 1.</…

Discussion

Her præsenterer vi en metode til at karakterisere T lymfocyt subpopulationer isoleret fra stenotiske aortaklappen prøver, ved hjælp af flow cytometri. Denne metode kræver brug af bestrålet buffycoat til at isolere PBMCs. Strålingsfrekvensen, som buffy coat poser skal udsættes for, er 9000 Rad/90 Gray (Gy), og det repræsenterer et afgørende skridt til at standse spredningen af feeder celler. Cellernes rolle isoleret fra buffy coat poser er kun at fungere som feeder celler og give næringsstoffer til T-celler isol…

Materials

50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801