Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell
Summary
In dieser Studie beschreiben wir den Prozess der T-Lymphozyten-Isolierung aus frischen Proben verkalkter Aortenklappen und die analytischen Schritte des T-Zell-Klonens zur Charakterisierung der adaptiven Leukozyten-Untergruppen unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse.
Abstract
Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD), ein aktiver Krankheitsprozess, der von einer leichten Verdickung der Klappe bis hin zu schwerer Verkalkung reicht, ist trotz neuer Therapieoptionen wie dem Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) mit einer hohen Mortalität verbunden.
Die kompletten Wege, die mit der Klappenverkalkung beginnen und zu einer schweren Aortenstenose führen, bleiben nur teilweise verstanden. Durch eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo könnte die Untersuchung von T-Lymphozyten aus stenotischem Klappengewebe ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Entwicklung der Verkalkung zu klären. Nach der chirurgischen Exzision wird die frische Aortenklappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Lymphozyten werden kultiviert, kloniert und dann mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert.
Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können auch mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Ergebnisse können verwendet werden, um Änderungen der T-Zell-Konzentrationen im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Subtypen von Interesse zu bewerten. In dieser Studie zeigen wir die Isolierung von T-Zellen, die an frisch verkalkten Aortenklappenproben durchgeführt wurden, und die Schritte der Analyse von T-Zell-Klonen mittels Durchflusszytometrie, um die Rolle der adaptiven Immunität in der CAVD-Pathophysiologie besser zu verstehen.
Introduction
Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine der häufigsten Herzklappenerkrankungen mit starken Auswirkungen auf das Gesundheitswesen. Die Häufigkeit des Aortenklappenersatzes hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen und wird aufgrund der wachsenden älteren Bevölkerung voraussichtlich weiter zunehmen1.
Die zugrunde liegende Pathophysiologie der CAVD ist nur teilweise bekannt und die aktuellen therapeutischen Strategien beschränken sich auf konservative Maßnahmen oder Aortenklappenersatz, entweder durch chirurgische oder perkutane Verfahren. Bis heute kann keine wirksame medizinische Behandlung das Fortschreiten der CAVD behindern oder umkehren, und eine hohe Mortalität ist mit einem frühen Symptombeginn verbunden, es sei denn, es wird ein Aortenklappenersatz (AVR) durchgeführt2. Bei Patienten mit schwerer symptomatischer Aortenstenose wurde das symptomfreie 3-Jahres-Überleben von nur 20%3 berichtet. Der Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) stellt eine neue Option dar, die die Behandlung von Hochrisikopatienten, insbesondere bei älteren Menschen, revolutioniert und die Mortalität, die in dieser Population an sich hoch war, dramatisch gesenkt hat4,5,6. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse von TAVR ist weitere Forschung notwendig, um die CAVD-Pathophysiologie zu verstehen, um neue frühe therapeutische Ziele zu identifizieren7,8,9.
CAVD, das früher als passiver, degenerativer Prozess angesehen wurde, wird heute als aktive progressive Erkrankung anerkannt, die durch einen osteoblastischen Phänotypschalter der Aortenklappen-Interstitialzellen gekennzeichnet ist10. Diese Krankheit beinhaltet eine fortschreitende Mineralisierung, fibrokalzische Veränderungen und eine verminderte Motilität der Aortenklappenblättchen (Sklerose), die letztendlich den Blutfluss behindern, was zu einer Verengung (Stenose) der Aortenklappenöffnung führt11.
Entzündung gilt als ein Schlüsselprozess in der CAVD-Pathophysiologie, ähnlich dem Prozess der vaskulären Atherosklerose. Endothelschäden ermöglichen die Ablagerung und Akkumulation von Lipidspezies, insbesondere von oxidierten Lipoproteinen in der Aortenklappe12. Diese oxidierten Lipoproteine provozieren eine Entzündungsreaktion, da sie zytotoxisch sind, wobei die entzündliche Aktivität zu einer Mineralisierung führt. Die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunität bei der CAVD-Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheit wurde kürzlich hervorgehoben13. Die Aktivierung und klonale Expansion spezifischer Untergruppen von Gedächtnis-T-Zellen wurde bei Patienten mit CAVD und mineralisierten Aortenklappenblättchen dokumentiert, so dass angenommen wird, dass entzündliche Prozesse zumindest an der Entstehung von CAVD und vermutlich auch am Krankheitsverlauf beteiligt sind14. Obwohl Antigen-präsentierende Zellen und Makrophagen sowohl in der gesunden als auch in der erkrankten Klappe vorhanden sind, deutet das Vorhandensein von T-Lymphozyten auf eine gealterte und erkrankte Aortenklappe hin. Dieses lymphozytäre Infiltrat zusammen mit einer Zunahme der Neovaskularisation und Metaplasie sind charakteristische histologische Anzeichen von CAVD15.
Wir stellen die Hypothese auf, dass es eine Wechselwirkung zwischen den Aortenklappen-Interstitialzellen und der Aktivierung des Immunsystems gibt, die möglicherweise die Initiierung eines chronischen Entzündungsprozesses in der Aortenklappe auslöst. Das Assaying von T-Zellen aus stenotischem Aortenklappengewebe könnte ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Verkalkungsentwicklung zu klären, da es eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo liefern kann. In der vorliegenden Arbeit isolieren wir unter Verwendung von Aortenklappengewebe T-Lymphozyten, kultivieren und klonen sie und charakterisieren sie anschließend mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Frische Aortenklappenproben wurden von CAVD-Patienten entnommen, die einen chirurgischen Klappenersatz für schwere Aortenstenose erhielten. Nach der chirurgischen Exzision wurde die frische Klappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Zellen wurden kultiviert, kloniert und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Daten können verwendet werden, um Veränderungen in der T-Lymphozytenverteilung im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Untergruppen von Interesse zu bewerten.
Die Extraktion von verkalktem Gewebe, die Isolierung von Leukozyten aus verkalktem Gewebe und insbesondere die Verwendung von Durchflusszytometrie an dieser Art von Gewebe kann aufgrund von Problemen wie Autofluoreszenz eine Herausforderung darstellen. Es gibt nur wenige Publikationen mit Protokollen für diesen speziellen Zweck16,17,18. Hierin stellen wir ein Protokoll vor, das speziell für die direkte Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten aus menschlichen Aortenklappenproben entwickelt wurde. Klonale Expansion von Lymphozyten ist ein Kennzeichen der adaptiven Immunität. Die Untersuchung dieses Prozesses in vitro liefert aufschlussreiche Informationen über die Heterogenität der Lymphozyten19. Nach einer dreiwöchigen Inkubationszeit sind die T-Zell-Klone bereit für die Explantation, da aus jedem Klon eine ausreichende Menge an T-Zellen gewonnen wurde, um die phänotypische und funktionelle Untersuchung zu ermöglichen. Anschließend wird der Phänotyp von T-Klonen mittels Zytofluorometrie untersucht.
Dieses immunologische Protokoll ist eine Adaption einer Methode, die zuvor von Amedei et al. zur Isolierung und Charakterisierung von T-Zellen aus menschlichem Gewebe entwickelt wurde und speziell für verkalktes menschliches Gewebe entwickelt wurde, wie in CAVD20,21,22. Das Protokoll hier für die Isolierung von PBMCs (periphere mononukleäre Blutzellen) unter Verwendung von bestrahltem Buffy Coat beschreibt einen effektiven Weg, um Feederzellen (FC) zu erhalten, die speziell auf die Klonphase von T-Lymphozyten eingestellt sind, die aus ventilinterstitiellen Zellen isoliert wurden. Die Feederschicht besteht aus im Wachstum gestoppten Zellen, die noch lebensfähig und bioaktiv sind. Die Rolle von Feederzellen ist wichtig, um das In-vitro-Überleben und das Wachstum von T-Lymphozyten zu unterstützen, die aus Ventil-Interstitialzellen isoliert wurden23. Um die Proliferation von Feederzellen in Kultur zu vermeiden, müssen diese Zellen einen Wachstumsstillstand durchlaufen. Dies kann auf zwei Arten erreicht werden: durch physikalische Methoden wie Bestrahlung oder durch die Behandlung mit zytotoxischen Chemikalien wie Mitomycin C (MMC), einem antitumoralen Antibiotikum, das direkt auf die Kulturoberfläche aufgetragen werden kann24. Hier zeigen wir den Stopp des Feederzellwachstums, der durch Zellbestrahlung erreicht wird.
Diese Methode stellt eine effiziente, kostengünstige Möglichkeit dar, T-Zellen aus Aortenklappengewebe zu isolieren und zu charakterisieren, was dazu beiträgt, das Spektrum immunologischer Methoden zur Erforschung der CAVD-Pathophysiologie zu erweitern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine Methode zur Charakterisierung von T-Lymphozyten-Subpopulationen vor, die aus stenotischen Aortenklappenproben isoliert wurden, mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode erfordert die Verwendung von bestrahltem Buffy Coat, um die PBMCs zu isolieren. Die Strahlungsfrequenz, der die Buffy-Coat-Beutel ausgesetzt werden müssen, beträgt 9000 Rad/90 Gray (Gy) und stellt einen entscheidenden Schritt dar, um die Proliferation der Feederzellen zu stoppen. Die Rolle der aus den Buffy-Coat-Beuteln isolierte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle für dieses Protokoll verwendeten Mantelbeutel wurden dank der Verfügbarkeit von Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer und dem gesamten Team der Radiologie der Charité Benjamin Franklin bestrahlt. Stipendiatin/Mary Roxana Christopher, diese Arbeit wird durch ein Stipendium der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie (DGK) unterstützt.
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
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