Undersøker aortaventilkalkning via isolasjon og kultur av T-lymfocytter ved hjelp av materceller fra bestrålet Buffy Coat

Summary

I denne studien beskriver vi prosessen med T-lymfocyttisolasjon fra ferske prøver av forkalkede aortaventiler og de analytiske trinnene i T-cellekloning for karakterisering av adaptive leukocyttundergrupper ved hjelp av strømningscytometrianalyse.

Abstract

Calcific aorta ventil sykdom (CAVD), en aktiv sykdomsprosess som spenner fra mild fortykning av ventilen til alvorlig forkalkning, er forbundet med høy dødelighet, til tross for nye terapeutiske alternativer som transkateter aortaventil erstatning (TAVR).

De komplette veiene som starter med ventilforkalkning og fører til alvorlig aortastenose forblir bare delvis forstått. Ved å gi en nær representasjon av aortaventilcellene in vivo, kan analysen av T-lymfocytter fra stenotisk ventilvev være en effektiv måte å avklare deres rolle i utviklingen av forkalkning. Etter kirurgisk eksisjon dissekeres den ferske aortaventilprøven i små biter, og T-lymfocyttene dyrkes, klones og analyseres deretter ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS).

Fargingsprosedyren er enkel og de fargede rørene kan også festes ved hjelp av 0,5% av paraformaldehyd og analyseres opptil 15 dager senere. Resultatene generert fra fargingspanelet kan brukes til å spore endringer i T-cellekonsentrasjoner over tid i forhold til intervensjon og kan enkelt videreutvikles for å vurdere aktiveringstilstander av spesifikke T-celleundertyper av interesse. I denne studien viser vi isolasjonen av T-celler, utført på ferske forkalkede aortaventilprøver og trinnene for å analysere T-cellekloner ved hjelp av strømningscytometri for å forstå rollen som adaptiv immunitet i CAVD patofysiologi.

Introduction

Calcific aortaklaffsykdom (CAVD) er en av de vanligste hjerteklaffforstyrrelsene, med stor innvirkning på helsevesenet. Hyppigheten av aortaventilerstatning de siste årene har økt dramatisk og forventes å øke ytterligere på grunn av den voksende eldre ^{befolkningen1}.

Den underliggende patofysiologien til CAVD er bare delvis kjent, og de nåværende terapeutiske strategiene er begrenset til konservative tiltak eller aortaventilerstatning, enten gjennom kirurgiske eller perkutane prosedyrer. Til dags dato kan ingen effektiv medisinsk behandling hindre eller reversere CAVD-progresjon og høy dødelighet er forbundet med tidlig symptomstart, med mindre aortaventilerstatning (AVR) ^utføres2. Hos pasienter med alvorlig symptomatisk aortastenose ble den 3-årige symptomfrie overlevelsen rapportert så lavt som 20%³. Transkateter aortaventilerstatning (TAVR) representerer et nytt alternativ, revolusjonerende behandling for høyrisikopasienter, spesielt blant eldre og har dramatisk redusert dødeligheten, som var iboende høy i denne ^{befolkningen4,5,6}. Til tross for de lovende resultatene fra TAVR, er videre forskning nødvendig for å forstå CAVD patofysiologi for å identifisere nye tidlige terapeutiske ^mål7,8,9.

Tidligere antatt å være en passiv, degenerativ prosess, er CAVD nå anerkjent som en aktiv progressiv sykdom, preget av en osteoblastisk fenotypebryter av aortaventilen interstitielle ^celler10. Denne sykdommen innebærer progressiv mineralisering, fibrokaltiske endringer og redusert bevegelighet av aortaventilbrosjyrene (sklerose), som til slutt hindrer blodstrømmen som fører til innsnevring (stenose) av aortaventilåpningen11.

Betennelse betraktes som en nøkkelprosess i CAVD patofysiologi, som ligner prosessen med vaskulær aterosklerose. Endotelskade muliggjør avsetning og akkumulering av lipidarter, spesielt oksidert lipoproteiner i aortaventilen12. Disse oksiderte lipoproteinene provoserer en inflammatorisk respons, da de er cytotoksiske, med den inflammatoriske aktiviteten som fører til mineralisering. Rollen som medfødt og adaptiv immunitet i CAVD-utvikling og sykdomsprogresjon har nylig blitt ^fremhevet13. Aktivering og klonisk utvidelse av spesifikke undergrupper av minne T-celler er dokumentert hos pasienter med CAVD og mineraliserte aortaventilbrosjyrer, slik at inflammatoriske prosesser antas å være involvert i det minste i utviklingen av CAVD og antagelig i sykdomsprogresjon ^også14. Faktisk, selv om antigen-presenterende celler og makrofager er til stede i både den sunne og syke ventilen, er tilstedeværelsen av T-lymfocytter indikativ for en alderen og syk aortaventil. Denne lymfocytiske infiltraten sammen med en økning i neovascularization og metaplasi er karakteristiske histologiske tegn på ^CAVD15.

Vi hypoteser eksistensen av en interaksjon mellom aortaventilens interstitialceller og aktiveringen av immunsystemet, noe som potensielt utløser initiering av en kronisk inflammatorisk prosess i aortaventilen. Analysen av T-celler fra stenotisk aortaventilvev kan være en effektiv måte å avklare sin rolle i forkalkningsutvikling, da det kan gi en nær representasjon av aortaventilcellene in vivo. I det nåværende arbeidet, ved hjelp av aortaventilvev, isolerer vi T-lymfocytter, kultur og kloner dem, og karakteriserer dem deretter ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Ferske aortaventilprøver ble utskilt fra CAVD-pasienter som fikk kirurgisk ventilerstatning for alvorlig aortastenose. Etter kirurgisk eksisjon ble den ferske ventilprøven dissekert i små biter og T-cellene ble dyrket, klonet og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Fargingsprosedyren er enkel og de fargede rørene kan festes ved hjelp av 0,5% av paraformaldehyd og analyseres opptil 15 dager senere. Dataene som genereres fra fargingspanelet kan brukes til å spore endringer i T-lymfocyttfordeling over tid i forhold til intervensjon og kan enkelt videreutvikles for å vurdere aktiveringstilstander av spesifikke T-celledelsett av interesse.

Utvinning av forkalket vev, isolering av leukocytter fra forkalket vev og spesielt bruk av strømningscytometri på denne typen vev kan være utfordrende, på grunn av problemer som autofluorescence. Det finnes få publikasjoner med protokoller for dette spesifikke formålet16,17,18. Her presenterer vi en protokoll designet spesielt for direkte isolasjon og kultur av T-lymfocytt fra humane aortaventilprøver. Clonal utvidelse av lymfocytter er et kjennetegn på adaptiv immunitet. Å studere denne prosessen in vitro gir innsiktsfull informasjon om nivået av lymfocytt ^{heterogenitet19}. Etter en tre ukers inkubasjonsperiode er T-celleklonene klare til å bli fremskyndet, da en tilstrekkelig mengde T-celler fra hver klone ble oppnådd, for å tillate fenotypisk og funksjonell studie. Deretter studeres fenotypen av T-kloner ved cytofluorometri.

Denne immunologiske protokollen er en tilpasning av en metode som tidligere ble utviklet av Amedei et al. for T-celleisolasjon og karakterisering fra humant vev, spesielt designet for forkalket menneskelig vev, for eksempel i CAVD20,21,22. Protokollen her for isolering av PBMCer (perifere blodmonykleære celler) ved hjelp av bestrålet buffy coat beskriver en effektiv måte å skaffe materceller (FC), spesielt justert for kloningsfasen av T-lymfocytter isolert fra ventilinterstitielle celler. Materlaget består av i vekst arresterte celler, som fortsatt er levedyktige og bioaktive. Matercellens rolle er viktig for å støtte in vitro overlevelse og vekst av T-lymfocytter isolert fra ventilinterstitielle ^celler23. For å unngå spredning av materceller i kulturen, må disse cellene gjennomgå en vekststans. Dette kan oppnås på to måter: gjennom fysiske metoder som bestråling, eller gjennom behandling med cytotoksiske kjemikalier, som mitomycin C (MMC), et antitumoralt antibiotika som kan påføres direkte på ^{kulturoverflaten24}. Her viser vi matercellevekst arrestasjon oppnådd gjennom cellebestråling.

Denne metoden presenterer en effektiv, kostnadseffektiv måte å isolere og karakterisere T-celler fra aortaventilvev, noe som bidrar til å utvide spekteret av immunologiske metoder for å utforske CAVD patofysiologi.

Protocol

Studien ble gjennomført i henhold til Charité-vedtektene for å sikre god vitenskapelig praksis, og de juridiske retningslinjene og bestemmelsene om personvern og etikk ble respektert. Etikkkomiteen godkjente alle menneskelige eksperimenter, og pasientenes personvern og anonymitet ble opprettholdt i samsvar med reglene som er rapportert på etikkformen. MERK: For protokollen beskrevet nedenfor ble det brukt ferske humane stenotiske ventilprøver. 1. Reagens forbered…

Representative Results

Vi brukte en enkel og kostnadseffektiv metode for å karakterisere leukocyttpopulasjonen av ferske aortaventilprøver avledet fra menneskelige pasienter med alvorlig aortaventilstenose (se protokoll). Metoden for å isolere PBMCer er et viktig skritt for å skaffe materceller, som brukes i hvert trinn av eksperimentet (kloning, refeeding og splitting av faser) og muliggjør deteksjon og karakterisering av infiltrerende leukocytter i aortaventilprøver. De viktigste trinnene i denne metoden vises i fi…

Discussion

Her presenterer vi en metode for å karakterisere T-lymfocytt subpopulations isolert fra stenotiske aortaventilprøver, ved hjelp av strømningscytometri. Denne metoden krever bruk av bestrålet buffy frakk for å isolere PBMCene. Strålingsfrekvensen som de buffy frakkposene må utsettes for, er 9000 Rad/90 Gray (Gy), og det representerer et avgjørende skritt for å stoppe spredningen av matercellene. Cellenes rolle isolert fra de buffy frakkposene er å fungere bare som materceller og gi næringsstoffer til T-cellene …

Materials

50 mL plastic syringes	Fisherbrand	9000701
96- well U- bottom Multiwell plates	Greiner Bio-One	10638441
Bag Spike (needle free)	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421	Biolegend	560349
CD25 PE	Biolegend	302621
CD3 PE/Cy7	Biolegend	300316
CD4 Alexa Fluor 488	Biolegend	317419
CD45 Brilliant violet 711	Biolegend	304137
CD8 Brilliant violet 510	Biolegend	301047
Eppendorf tube 1.5 mL	Eppendorf	13094697
Eppendorf tube 0.5 mL	Thermo Scientific	AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube	Falcon	10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes	Falcon	10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes	BD	2300E
Fast read 102 plastic counting chamber	KOVA INTERNATIONAL	630-1893
Filters for culture medium 250 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	168-0045
Filters for culture medium 500 mL	NalgeneThermo Fisher Scientific	166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement	Irvine Scientific	T151
HB Basal Medium	Irvine Scientific	T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone	ECS0180L
HS (Human serum)	Sigma Aldrich	H3667
Human IL-2 IS	Miltenyi Biotec	130-097-744
L-Glutamine	Gibco	11140050
Lymphoprep	Falcon	352057
Non-essential amino acids solution	Sigma	11082132001
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	10538931
PBS (Phosphate-buffered saline)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070063	10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin)	Stem Cell Technologies	7811
Plastic Petri dishes	Thermo Scientific	R80115TS	10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media	HyClone	15-040-CV
Sodium pyruvate	Gibco by Life technologies	11360070
Syringe Filters 0,45µl	Rotilabo-Spritzenfilter	P667.1
T-25 Cell culture flasks	InvitrogenThermo Fisher Scientific	AM9625
T-75 Cell culture flask	Thermo Fisher Scientific	10232771
β- Mercaptoethanol	Gibco	A2916801