Исследование кальцификации аортального клапана путем выделения и культивирования Т-лимфоцитов с использованием фидерных клеток из облученной шерсти Баффи
Summary
В этом исследовании мы описываем процесс выделения Т-лимфоцитов из свежих образцов кальцинированных аортальных клапанов и аналитические этапы клонирования Т-клеток для характеристики адаптивных подмножеств лейкоцитов с использованием анализа проточной цитометрии.
Abstract
Кальцифицирующее заболевание аортального клапана (CAVD), активный процесс заболевания, начиная от легкого утолщения клапана до тяжелой кальцификации, связано с высокой смертностью, несмотря на новые терапевтические возможности, такие как транскатетерная замена аортального клапана (TAVR).
Полные пути, которые начинаются с кальцификации клапанов и приводят к тяжелому стенозу аорты, остаются лишь частично понятыми. Обеспечивая близкое представление клеток аортального клапана in vivo, анализ Т-лимфоцитов из стенотической ткани клапана может быть эффективным способом уточнения их роли в развитии кальцификации. После хирургического иссечения свежий образец аортального клапана рассекается на небольшие кусочки, а Т-лимфоциты культивируются, клонируются, а затем анализируются с использованием флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS).
Процедура окрашивания проста, и окрашенные трубки также могут быть зафиксированы с использованием 0,5% параформальдегида и проанализированы до 15 дней спустя. Результаты, полученные с панели окрашивания, могут быть использованы для отслеживания изменений концентраций Т-клеток с течением времени в отношении вмешательства и могут быть легко дополнительно разработаны для оценки состояний активации конкретных подтипов Т-клеток, представляющих интерес. В этом исследовании мы показываем изоляцию Т-клеток, выполненную на свежих кальцинированных образцах аортального клапана, и этапы анализа клонов Т-клеток с использованием проточной цитометрии для дальнейшего понимания роли адаптивного иммунитета в патофизиологии CAVD.
Introduction
Заболевание кальцификального аортального клапана (CAVD) является одним из наиболее распространенных нарушений сердечного клапана, оказывающих сильное влияние на здравоохранение. Частота замены аортального клапана в последние годы резко возросла и, как ожидается, будет увеличиваться и дальше, в связи с ростом пожилого населения1.
Основная патофизиология CAVD известна лишь частично, и современные терапевтические стратегии ограничены консервативными мерами или заменой аортального клапана, либо хирургическими, либо чрескожными процедурами. На сегодняшний день никакое эффективное медицинское лечение не может препятствовать или обращать вспять прогрессирование CAVD, а высокая смертность связана с ранним появлением симптомов, если не выполнена замена аортального клапана (AVR)2. У пациентов с тяжелым симптоматическим стенозом аорты 3-летняя безсимптомная выживаемость составляла всего 20%3. Транскатетерная замена аортального клапана (TAVR) представляет собой новый вариант, революционизирующий лечение пациентов с высоким риском, особенно среди пожилых людей, и резко снизил смертность, которая была по своей сути высокой в этой популяции4,5,6. Несмотря на многообещающие результаты TAVR, необходимы дальнейшие исследования для понимания патофизиологии CAVD для выявления новых ранних терапевтических целей7,8,9.
Ранее считавшийся пассивным, дегенеративным процессом, CAVD теперь признан активным прогрессирующим заболеванием, характеризующимся остеобластным фенотипом интерстициальных клеток аортального клапана10. Это заболевание включает прогрессирующую минерализацию, фиброкальцификальные изменения и снижение подвижности листков аортального клапана (склероз), которые в конечном итоге препятствуют кровотоку, приводя к сужению (стенозу) отверстия аортального клапана11.
Воспаление считается ключевым процессом в патофизиологии CAVD, похожим на процесс атеросклероза сосудов. Повреждение эндотелия позволяет откладывать и накапливать липидные виды, особенно окисленные липопротеины в аортальном клапане12. Эти окисленные липопротеины провоцируют воспалительную реакцию, так как они цитотоксичны, а воспалительная активность приводит к минерализации. Недавно была подчеркнута роль врожденного и адаптивного иммунитета в развитии CAVD и прогрессировании заболевания13. Активация и клональное расширение специфических подмножеств Т-клеток памяти были задокументированы у пациентов с CAVD и минерализованными листочками аортального клапана, так что предполагается, что воспалительные процессы участвуют, по крайней мере, в развитии CAVD и, по-видимому, в прогрессировании заболевания14. Фактически, хотя антигенпрезентирующие клетки и макрофаги присутствуют как в здоровом, так и в больном клапане, присутствие Т-лимфоцитов свидетельствует о стареющем и больном аортальном клапане. Этот лимфоцитарный инфильтрат наряду с увеличением неоваскуляризации и метаплазии являются характерными гистологическими признаками CAVD15.
Выдвигается гипотеза о существовании взаимодействия между интерстициальными клетками аортального клапана и активацией иммунной системы, что потенциально провоцирует инициацию хронического воспалительного процесса в аортальном клапане. Анализ Т-клеток из стенотической ткани аортального клапана может быть эффективным способом уточнения их роли в развитии кальцификации, поскольку он может обеспечить близкое представление клеток аортального клапана in vivo. В настоящей работе, используя ткань аортального клапана, мы изолируем Т-лимфоциты, культивируем и клонируем их, а затем характеризуем их с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Свежие образцы аортального клапана были вырезаны у пациентов с CAVD, которые получили хирургическую замену клапана при тяжелом аортальном стенозе. После хирургического иссечения свежий образец клапана рассекали на небольшие кусочки, а Т-клетки культивировали, клонировали, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Процедура окрашивания проста, и окрашенные трубки могут быть зафиксированы с использованием 0,5% параформальдегида и проанализированы до 15 дней спустя. Данные, полученные с панели окрашивания, могут быть использованы для отслеживания изменений в распределении Т-лимфоцитов с течением времени в отношении вмешательства и могут быть легко дополнительно разработаны для оценки состояний активации конкретных подмножеств Т-клеток, представляющих интерес.
Извлечение кальцинированной ткани, выделение лейкоцитов из кальцинированной ткани и, в частности, использование проточной цитометрии на этом типе ткани могут быть сложными из-за таких проблем, как автофлуоресценция. Существует несколько публикаций с протоколами для этой конкретной цели16,17,18. Здесь мы представляем протокол, разработанный специально для прямого выделения и культивирования Т-лимфоцитов из образцов аортального клапана человека. Клональное расширение лимфоцитов является отличительной чертой адаптивного иммунитета. Изучение этого процесса in vitro дает проницательную информацию об уровне гетерогенности лимфоцитов19. После трехнедельного инкубационного периода клоны Т-клеток готовы к эксплантации, так как из каждого клона было получено достаточное количество Т-клеток, чтобы позволить фенотипическое и функциональное исследование. Впоследствии фенотип Т-клонов изучается методом цитофторометрии.
Этот иммунологический протокол является адаптацией метода, ранее разработанного Amedei et al. для выделения и характеристики Т-клеток из тканей человека, специально разработанных для кальцинированных тканей человека, таких как в CAVD20,21,22. Протокол здесь для выделения PBMCs (мононуклеарных клеток периферической крови) с использованием облученной пухлой оболочки описывает эффективный способ получения фидерных клеток (FC), специально скорректированных для фазы клонирования Т-лимфоцитов, выделенных из интерстициальных клеток клапана. Питательный слой состоит из клеток с остановкой роста, которые все еще жизнеспособны и биологически активны. Роль фидерных клеток важна для поддержания выживания in vitro и роста Т-лимфоцитов, выделенных из интерстициальных клеток клапана23. Чтобы избежать пролиферации фидерных клеток в культуре, эти клетки должны пройти остановку роста. Это может быть достигнуто двумя способами: с помощью физических методов, таких как облучение, или путем лечения цитотоксическими химическими веществами, такими как митомицин С (MMC), противоопухолевый антибиотик, который может быть нанесен непосредственно на поверхность культуры24. Здесь мы показываем остановку роста клеток фидера, достигаемую путем облучения клеток.
Этот метод представляет собой эффективный, экономически эффективный способ выделения и характеристики Т-клеток из ткани аортального клапана, способствуя расширению спектра иммунологических методов изучения патофизиологии CAVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлен метод характеристики субпопуляций Т-лимфоцитов, выделенных из стенотических образцов аортального клапана, с использованием проточной цитометрии. Этот метод требует использования облученного пухлого слоя для изоляции PBMCs. Частота излучения, которой должны подверга?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Все пушистые пальто, используемые для этого протокола, были облучены благодаря наличию доктора Питера Розенталя, доктора Дирка Бёмера и всей команды отделения радиологии Charité Benjamin Franklin. Стипендиат / Мэри Роксана Кристофер, эта работа поддерживается стипендией немецкого кардиологического общества (DGK).
Materials
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: “on-label” versus “off-label” use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of “Not Effector” T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ –adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
