Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo’daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.
Pamuk bollworm, Helicoverpa armigera, dünyanın en yıkıcı zararlılarından biridir. Moleküler genetik, fizyoloji, fonksiyonel genomik ve davranışsal çalışmaların bir kombinasyonu , H. armigera’yı Lepidoptera Noctuidae’de örnek bir tür haline getirmiştir. Farklı genlerin in vivo fonksiyonlarını ve etkileşimlerini incelemek için düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/ ilişkili protein 9 (Cas9) genom düzenleme teknolojisi fonksiyonel genomik çalışmaların yapılmasında kullanılan uygun ve etkili bir yöntemdir. Bu çalışmada CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak H. armigera’da gen nakavtını tamamlamak için adım adım sistematik bir yöntem sunuyoruz. Kılavuz RNA’nın (gRNA) tasarımı ve sentezi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Daha sonra kılavuz RNA (gRNA) oluşturma, embriyo toplama, mikroenjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tespiti için gene özgü astar tasarımından oluşan sonraki adımlar özetlenmiştir. Son olarak, gen düzenlemenin verimliliğini artırmak için sorun giderme önerileri ve notları sağlanır. Yöntemimiz, CRISPR/Cas9 genom düzenlemenin H. armigera’da ve diğer Lepidopteran güvelerinde uygulanması için bir referans görevi görecektir.
Genom düzenleme teknolojisinin uygulanması, çeşitli türlerde hedef gen mutantlarına ulaşmak için etkili bir araç sağlar. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarların (CRISPR)/ilişkili protein 9 (Cas9) sisteminin ortaya çıkması genomları manipüle etmek için yeni bir yöntem sağlar1. CRISPR/Cas9 sistemi bir kılavuz RNA (gRNA) ve Cas9 endonuclease2,3’den oluşurken, gRNA iki bölüme ayrılabilir, hedef tamamlayıcı CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA). gRNA, Cas9 endonucleaz ile entegredir ve ribonikleoprotein (RNP) oluşturur. gRNA ile Cas9 endonucleaz, baz tamamlayıcısı yoluyla genomun belirli bir bölgesine yönlendirilebilir. Cas9’un RuvC ve HNH etki alanları, protospacer bitişik motif (PAM) dizisinden önce genomun hedef bölgesini üç temele ayırır ve çift iplikçikli bir mola (DSB) oluşturur. DNA bölünmesi daha sonra homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR)4 olmak üzere iki mekanizma ile onarılabilir. DSB’nin onarımı, hedeflenen geni devre dışı bırakmanın bir yolu olarak eklemeleri veya silmeleri tanıtır ve potansiyel olarak gen fonksiyonunun tamamen kaybına neden olur. Bu nedenle, CRISPR/Cas9 sisteminin sapkınlığı ve özgüllüğü, gen fonksiyonlarını in vivo olarak karakterize etmek ve gen etkileşimlerini analiz etmek için sağlam bir yöntem haline getirir5.
Crispr/Cas9 sistemi, biyotıp6,7, gen tedavisi8,9 ve tarım10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli alanlara uygulanmıştır ve mikroorganizmalar13, bitkiler14,15, nematodlar16 ve memeliler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemler için kullanılmıştır17 . Omurgasızlarda, meyve sineği Drosophila melanogaster ve 18,19,20,21,22 ötesi gibi birçok böcek türü CRISPR / Cas9 genom düzenlemesine tabi tutulmuştur.
Helicoverpa armigera dünya çapında en yıkıcı zararlılardan biridir23 ve pamuk, soya fasulyesi ve sorgum24,25 dahil olmak üzere çok sayıda ürüne zarar verir. Sıralama teknolojisinin gelişmesiyle, H. armigera’nın genomunun yanı sıra bir dizi Lepidoptera böcek türünün genomları tamamen sıralanmıştır26,27,28,29. Son yıllarda bu böceklerden çok sayıda direnç ve koku reseptör geni tanımlanmış ve karakterize edilmiştir19,27,28,29. H. armigera’da cadherin30, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı31,32 ve HaTSPAN133 için kodlanan genler gibi dirençle ilgili bazı genler tanımlanmıştır. CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak bu genlerin nakavtı, hassas suşlarda Bacillus thuringiensis (BT) toksinine karşı yüksek düzeyde dirençle sonuçlanır. Ayrıca, Chang ve arkadaşları (2017), çiftleşme süresi düzenlemesinde önemli işlevini doğrulayan bir feromon reseptörü devirdi19. Bu raporlar CRISPR/Cas9’un böcek sistemlerinde in vivo gen fonksiyonunu incelemek için etkili bir araç olarak işlev görebildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, böcek sistemlerinde CRISPR / Cas9 modifikasyonu için ayrıntılı bir prosedür eksik kalır, bu da böcek fonksiyonel genomiklerinde uygulama aralığını sınırlar.
Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak H. armigera’daki fonksiyonel bir geni yok etmek için bir protokol sunuyoruz. GRNA üretimi, embriyo toplama, mikroenjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tanımlama için gen spesifik astarların tasarımı ve hazırlanması dahil olmak üzere ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, H. armigera’daki herhangi bir fonksiyonel geni manipüle etmek için değerli bir referans görevi görür ve diğer Lepidoptera türlerine genişletilebilir.
CRISPR/Cas9 sisteminin uygulanması, gen fonksiyonunun ve çeşitli genler arasındaki etkileşimin analizi için güçlü teknik destek sağlamıştır. Burada sunduğumuz ayrıntılı protokol, CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi ile H. armigera’da homozigot mutantının neslini göstermektedir. Bu güvenilir prosedür, H. armigera’da yönlendirilmiş gen mutajenisi için basit bir yol sağlar.
CRISPR hedef sahalarının seçimi mutajensis verimliliğini etkile…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (gw 31861133019 31725023 ve CY için 31171912) tarafından desteklendi.
2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |