Summary

Микроинъекция эмбриона и нокаут-мутантная идентификация CRISPR/Cas9 Генетически отредактированная Helicoverpa Armigera (Hübner)

Published: July 01, 2021
doi:

Summary

Здесь представлен протокол микроинъекции эмбриона Helicoverpa armigera (Hübner) и нокаутирующей мутантной идентификации, созданный путем редактирования генома CRISPR/Cas9. Мутантные насекомые позволяют проводить дальнейшие исследования функции генов и взаимодействия между различными генами in vivo.

Abstract

Хлопковый червь, Helicoverpa armigera, является одним из самых разрушительных вредителей в мире. Сочетание молекулярной генетики, физиологии, функциональной геномики и поведенческих исследований сделало H. armigera модельным видом у Lepidoptera Noctuidae. Для изучения функций in vivo и взаимодействий между различными генами технология редактирования генома кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) / ассоциированного белка 9 (Cas9) является удобным и эффективным методом, используемым для выполнения функциональных геномных исследований. В этом исследовании мы предоставляем пошаговый систематический метод для завершения нокаута гена у H. armigera с использованием системы CRISPR / Cas9. Подробно описаны конструкция и синтез направляющей РНК (гРНК). Затем суммируются последующие этапы, состоящие из генно-специфического дизайна праймера для создания направляющей РНК (гРНК), сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и обнаружения мутантов. Наконец, предоставляются рекомендации и заметки по устранению неполадок для повышения эффективности редактирования генов. Наш метод будет служить справочным материалом для применения редактирования генома CRISPR/Cas9 у H. armigera , а также у других чешуекрылых мотыльков.

Introduction

Применение технологии редактирования генома обеспечивает эффективный инструмент для достижения мутантов генов-мишеней у различных видов. Появление системы кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/ассоциированного белка 9 (Cas9) обеспечивает новый метод манипулирования геномами1. Система CRISPR/Cas9 состоит из направляющей РНК (гРНК) и эндонуклеазы Cas92,3, в то время как гРНК может быть дополнительно разделена на две части: целевую комплементарную CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующую crRNA (tracrRNA). ГРНК интегрируется с эндонуклеазой Cas9 и образует рибонуклеопротеин (RNP). С гРНК эндонуклеаза Cas9 может быть направлена на определенный участок генома посредством комплементации основания. Домены RuvC и HNH Cas9 расщепляют целевой участок генома на три основания перед последовательностью протоспейсер-смежных мотивов (PAM) и создают двухцепочечный разрыв (DSB). Затем расщепление ДНК может быть восстановлено с помощью двух механизмов: негомологичного конечного соединения (NHEJ) или гомологического репарации (HDR)4. Восстановление DSB вводит вставки или делеции как способ инактивации целевого гена, потенциально вызывая полную потерю функции гена. Следовательно, углеродистость и специфичность системы CRISPR/Cas9 делают ее надежным методом для характеристики функций генов in vivo и анализа взаимодействий генов5.

С многочисленными достоинствами система CRISPR/Cas9 применяется в различных областях, включая биомедицину6,7, генную терапию8,9 и сельское хозяйство10,11,12, и используется для различных биологических систем, включая микроорганизмы13, растения14,15, нематоды16 и млекопитающих17 . У беспозвоночных многие виды насекомых были подвергнуты редактированию генома CRISPR/Cas9, такие как плодовая муха Drosophila melanogaster и более 18,19,20,21,22.

Helicoverpa armigera является одним из самых разрушительных вредителей во всем мире23 и повреждает многочисленные культуры, включая хлопок, сою и сорго24,25. С развитием технологии секвенирования геном H. armigera, а также ряд видов насекомых Lepidoptera были полностью секвенированы 26,27,28,29. Большое количество генов резистентности и обонятельных рецепторов было идентифицировано и охарактеризовано от этих насекомых в последние годы19,27,28,29. Некоторые гены, связанные с резистентностью, были идентифицированы у H. armigera, такие как гены, кодирующие cadherin30, АТФ-связывающий кассетный транспортер31,32, а также HaTSPAN133. Нокаут этих генов с использованием технологии CRISPR/Cas9 приводит к высокому уровню устойчивости к токсину Bacillus thuringiensis (BT) у восприимчивых штаммов. Кроме того, Chang et al. (2017) выбили феромонный рецептор, который подтвердил его важную функцию в регулировании времени спаривания19. Эти отчеты свидетельствуют о том, что CRISPR/ Cas9 может выступать в качестве эффективного инструмента для изучения функции генов in vivo в системах насекомых. Однако подробная процедура модификации CRISPR/Cas9 в системах насекомых остается неполной, что ограничивает диапазон ее применения в функциональной геномике насекомых.

Здесь мы представляем протокол для выбивания функционального гена у H. armigera с использованием системы CRISPR/Cas9. Предоставляется подробный пошаговый протокол, включая разработку и подготовку генно-специфических праймеров для производства гРНК, сбора эмбрионов, микроинъекции, выращивания насекомых и идентификации мутантов. Этот протокол служит ценным справочным материалом для манипулирования любыми функциональными генами у H. armigera и может быть распространен на другие виды чешуекрылых.

Protocol

1. Проектирование геноспецифических праймеров и получение sgRNA Проверка сохраненной геномной области в интересующем гене с помощью анализа амплификации и секвенирования ПЦР. Амплифицируйте ген-мишень из геномной ДНК H. armigera и различайте экзоны и интроны.ПРИМЕЧАНИЕ: Специфи?…

Representative Results

Этот протокол предоставляет подробные шаги для получения линий нокаута генов H. armigera с использованием технологии CRISPR/Cas9. Репрезентативные результаты, полученные по этому протоколу, обобщены для отбора гДНК, сбора и инъекции эмбрионов, выращивания насекомых и обн?…

Discussion

Применение системы CRISPR/Cas9 обеспечило мощную техническую поддержку для анализа функции генов и взаимодействия между различными генами. Подробный протокол, который мы представляем здесь, демонстрирует генерацию гомозиготного мутанта в H. armigera посредством редактирования генома CRISP…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31725023, 31861133019 в GW и 31171912 в CY).

Materials

2kb DNA ladder TransGen Biotech BM101
Capillary Glass World Precision Instrucments 504949 referred to as "capillary glass" in the protocol
Double Sided Tape Minnesota Mining and Manufacturing Corporation 665
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector Eppendorf Corporate E5252000021
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf Corporate 5192000051
Eppendorf Microloader Pipette Tips Eppendorf Corporate G2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Microscope Slide Sail Brand 7105
Olympus Microscope Olympus Corporation SZX16
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040 used for mutant detection
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Company P-1000
TIANamp Genomic DNA Kit TIANGEN Corporate DP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36499

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  5. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  6. Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
  7. Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
  8. Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
  9. Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
  10. Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
  11. Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
  12. Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
  13. Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
  14. Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
  15. Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
  16. Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  17. Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
  18. Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  19. Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
  20. Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
  21. Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
  22. Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
  23. Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
  24. Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
  25. Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
  26. Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  27. Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
  28. Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
  29. Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  30. Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
  31. Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
  32. Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
  33. Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
  34. Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
  35. Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
  36. Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
  37. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
  38. Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
  39. Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
  40. Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
  41. Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).

Play Video

Cite This Article
Ai, D., Wang, B., Fan, Z., Fu, Y., Yu, C., Wang, G. Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner). J. Vis. Exp. (173), e62068, doi:10.3791/62068 (2021).

View Video