Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)
Summary
Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.
Abstract
El gusano del algodón, Helicoverpa armigera, es una de las plagas más destructivas del mundo. Una combinación de genética molecular, fisiología, genómica funcional y estudios de comportamiento ha hecho de H. armigera una especie modelo en Lepidoptera Noctuidae. Para estudiar las funciones in vivo y las interacciones entre diferentes genes, la tecnología de edición del genoma agrupadas regularmente interespaciadas de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / proteína 9 asociada (Cas9) es un método conveniente y efectivo utilizado para realizar estudios genómicos funcionales. En este estudio, proporcionamos un método sistemático paso a paso para completar la eliminación de genes en H. armigera utilizando el sistema CRISPR / Cas9. El diseño y la síntesis del ARN guía (ARNg) se describen en detalle. Luego, se resumen los pasos posteriores que consisten en el diseño de cebadores específicos de genes para la creación de ARN guía (ARNg), la recolección de embriones, la microinyección, la cría de insectos y la detección de mutantes. Finalmente, se proporcionan consejos y notas para la solución de problemas para mejorar la eficiencia de la edición de genes. Nuestro método servirá como referencia para la aplicación de la edición del genoma CRISPR/Cas9 en H. armigera así como en otras polillas lepidópteras.
Introduction
La aplicación de la tecnología de edición del genoma proporciona una herramienta eficiente para lograr mutantes de genes objetivo en diversas especies. La aparición del sistema agrupado de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)/proteína 9 asociada (Cas9) agrupadas regularmente interespaciadas proporciona un método novedoso para manipular genomas1. El sistema CRISPR/Cas9 consiste en un ARN guía (ARNg) y la endonucleasa Cas92,3, mientras que el ARNg se puede dividir en dos partes, un ARN CRISPR complementario objetivo (ARNcr) y un ARNcr transactivante (ARNtra). El ARNg se integra con la endonucleasa Cas9 y forma una ribonucleoproteína (RNP). Con el ARNg, la endonucleasa Cas9 se puede dirigir a un sitio específico del genoma a través de la complementación de la base. Los dominios RuvC y HNH del Cas9 escinden el sitio objetivo del genoma tres bases antes de la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) y crean una ruptura de doble hebra (DSB). La escisión del ADN se puede reparar a través de dos mecanismos, la unión final no homóloga (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR)4. La reparación del DSB introduce inserciones o deleciones como una forma de inactivar el gen objetivo, lo que podría causar una pérdida completa de la función del gen. Por lo tanto, la heredabilidad y la especificidad del sistema CRISPR/Cas9 lo convierten en un método robusto para caracterizar las funciones genéticas in vivo y analizar las interacciones génicas5.
Con numerosos méritos, el sistema CRISPR/Cas9 se ha aplicado a diversos campos, incluyendo la biomedicina6,7, la terapia génica8,9 y la agricultura10,11,12, y se ha utilizado para diversos sistemas biológicos incluyendo microorganismos13, plantas14,15, nematodos16 y mamíferos17 . En los invertebrados, muchas especies de insectos han sido sometidas a la edición del genoma CRISPR/Cas9, como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y más allá18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera es una de las plagas más destructivas a nivel mundial23, y daña numerosos cultivos, incluyendo algodón, soja y sorgo24,25. Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación, el genoma de H. armigera, así como el de una serie de especies de insectos lepidópteros, han sido secuenciados completamente26,27,28,29. En los últimos años se han identificado y caracterizado un gran número de genes de resistencia y receptores olfativos de estos insectos19,27,28,29. Se han identificado algunos genes relacionados con la resistencia en H. armigera, como los genes que codifican para cadherina30, un transportador de casete de unión a ATP31,32, así como HaTSPAN133. La eliminación de estos genes utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 da como resultado un alto nivel de resistencia a la toxina Bacillus thuringiensis (BT) en cepas susceptibles. Además, Chang et al. (2017) eliminaron un receptor de feromonas, lo que validó su función significativa en la regulación del tiempo de apareamiento19. Estos informes sugieren que CRISPR / Cas9 puede actuar como una herramienta efectiva para estudiar la función génica in vivo en los sistemas de insectos. Sin embargo, un procedimiento detallado para la modificación de CRISPR / Cas9 en sistemas de insectos sigue siendo incompleto, lo que limita su rango de aplicación en genómica funcional de insectos.
Aquí, presentamos un protocolo para eliminar un gen funcional en H. armigera utilizando el sistema CRISPR/Cas9. Se proporciona un protocolo detallado paso a paso, que incluye el diseño y la preparación de cebadores específicos de genes para la producción de ARNg, la recolección de embriones, la microinyección, la cría de insectos y la identificación de mutantes. Este protocolo sirve como una referencia valiosa para manipular cualquier gen funcional en H. armigera y se puede extender a otras especies de lepidópteros.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aplicación del sistema CRISPR/Cas9 ha proporcionado un potente soporte técnico para el análisis de la función génica y la interacción entre varios genes. El protocolo detallado que presentamos aquí demuestra la generación de un mutante homocigoto en H. armigera a través de la edición del genoma CRISPR/Cas9. Este procedimiento confiable proporciona una forma sencilla para la mutagénesis genética dirigida en H. armigera.
La elección de los sitios diana CRISPR po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31725023, 31861133019 a GW y 31171912 a CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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