Embryo Microinjection och Knockout Mutant Identification av CRISPR/Cas9 Genom-Redigerad Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
Presenteras här är ett protokoll av Helicoverpa armigera (Hübner) embryo microinjection och knockout mutant identifiering skapad av CRISPR/Cas9 genomredigering. Mutanta insekter möjliggör ytterligare forskning om genfunktion och interaktion mellan olika gener in vivo.
Abstract
Bomullsbollmasken, Helicoverpa armigera, är en av de mest destruktiva skadedjuren i världen. En kombination av molekylär genetik, fysiologi, funktionell genomik och beteendestudier har gjort H. armigera till en modellart i Lepidoptera Noctuidae. För att studera in vivo-funktionerna hos och interaktioner mellan olika gener är grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR)/ tillhörande protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknik en bekväm och effektiv metod som används för att utföra funktionella genomiska studier. I denna studie tillhandahåller vi en steg-för-steg systematisk metod för att slutföra gen knockout i H. armigera med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet. Utformningen och syntesen av guide RNA (gRNA) beskrivs i detalj. Sedan sammanfattas de efterföljande stegen som består av genspecifik primerdesign för guide RNA (gRNA) skapande, embryosamling, mikroinjektion, insektsuppfödning och mutantdetektering. Slutligen ges felsökningsråd och anteckningar för att förbättra effektiviteten i genredigering. Vår metod kommer att fungera som referens för tillämpningen av CRISPR/ Cas9 genomredigering i H. armigera samt andra Lepidopteran moths.
Introduction
Tillämpningen av genomredigeringsteknik ger ett effektivt verktyg för att uppnå målgenmutanter i olika arter. Framväxten av det grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/associerade protein 9 (Cas9) systemet ger en ny metod för att manipulera genom1. CRISPR/Cas9-systemet består av en guide RNA (gRNA) och Cas9 endonuclease2,3, medan gRNA kan delas in ytterligare i två delar, ett mål kompletterande CRISPR RNA (crRNA) och en transaktiverande crRNA (tracrRNA). GRNA integreras med Cas9 endonuclease och bildar ett ribonucleoprotein (RNP). Med gRNA kan Cas9 endonuclease dirigeras till en specifik plats för genomet via baskomplementation. RuvC- och HNH-domänerna i Cas9 klyver målplatsen för genomet tre baser före den protospacer-intilliggande motivsekvensen (PAM) och skapar en dubbelsträngsbrytning (DSB). DNA-klyvningen kan sedan repareras genom två mekanismer, icke-homolog end join (NHEJ) eller homology-directed repair (HDR)4. Reparation av DSB introducerar infogningar eller borttagningar som ett sätt att inaktivera den riktade genen, vilket potentiellt orsakar en fullständig förlust av genfunktionen. Därför gör crispr/cas9-systemets härdikerbara och specificitet det till en robust metod för att karakterisera genfunktioner in vivo och analysera geninteraktioner5.
Med många fördelar har CRISPR/Cas9-systemet tillämpats på olika områden, inklusive biomedicin6,7, genterapi8,9 och jordbruk10,11,12, och har använts för olika biologiska system inklusive mikroorganismer13, växter14,15, nematoder16 och däggdjur17 . Hos ryggradslösa djur har många insektsarter utsatts för CRISPR/Cas9-genomredigering, såsom fruktflugan Drosophila melanogaster och bortom 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera är en av de mest destruktiva skadedjuren i världen23, och skadar många grödor, inklusive bomull, sojabönor och sorghum24,25. Med utvecklingen av sekvenseringsteknik har arvsmassan hos H. armigera, liksom en rad lepidoptera insektsarter, sekvenserats helt26,27,28,29. Ett stort antal resistens- och luktreceptorgener har identifierats och karakteriserats från dessa insekter under de senaste åren19,27,28,29. Vissa resistensrelaterade gener har identifierats i H. armigera, såsom generna som kodar för cadherin30, en ATP-bindande kassetttransportör31,32, samt HaTSPAN133. Knockout av dessa gener med CRISPR/Cas9-teknik resulterar i en hög resistens mot Bacillus thuringiensis (BT) toxin i mottagliga stammar. Dessutom slog Chang et al. (2017) ut en feromonreceptor, som validerade sin signifikanta funktion i parningstidsreglering19. Dessa rapporter tyder på att CRISPR/Cas9 kan fungera som ett effektivt verktyg för att studera genfunktionen in vivo i insektssystem. Ett detaljerat förfarande för CRISPR/Cas9-modifiering i insektssystem är dock fortfarande ofullständigt, vilket begränsar dess tillämpningsområde inom insektsfunktionell genomik.
Här presenterar vi ett protokoll för att slå ut en funktionell gen i H. armigera med CRISPR/ Cas9-systemet. Ett detaljerat steg-för-steg-protokoll tillhandahålls, inklusive design och beredning av genspecifika primers för gRNA-produktion, embryosamling, mikroinjektion, insektsuppfödning och mutantidentifiering. Detta protokoll fungerar som en värdefull referens för att manipulera alla funktionella gener i H. armigera och kan utvidgas till andra Lepidoptera arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillämpningen av CRISPR/Cas9-systemet har gett kraftfullt tekniskt stöd för analys av genfunktion och interaktion mellan olika gener. Det detaljerade protokollet vi presenterar här visar genereringen av en homozygote mutant i H. armigera via CRISPR/Cas9 genomredigering. Detta tillförlitliga förfarande ger ett enkelt sätt för riktade gen mutagenes i H. armigera.
Valet av CRISPR-målplatser kan påverka mutageneseffektiviteten37. I detta protokol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 till GW och 31171912 till CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
