Summary

CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Published: July 01, 2021
doi:

Summary

Burada CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi tarafından oluşturulan Helicoverpa armigera (Hübner) embriyo mikroenjeksiyonu ve nakavt mutant tanımlama protokolü sunulmaktadır. Mutant böcekler, in vivo’daki farklı genler arasında gen fonksiyonu ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasına olanak tanır.

Abstract

Pamuk bollworm, Helicoverpa armigera, dünyanın en yıkıcı zararlılarından biridir. Moleküler genetik, fizyoloji, fonksiyonel genomik ve davranışsal çalışmaların bir kombinasyonu , H. armigera’yı Lepidoptera Noctuidae’de örnek bir tür haline getirmiştir. Farklı genlerin in vivo fonksiyonlarını ve etkileşimlerini incelemek için düzenli olarak kümelenmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/ ilişkili protein 9 (Cas9) genom düzenleme teknolojisi fonksiyonel genomik çalışmaların yapılmasında kullanılan uygun ve etkili bir yöntemdir. Bu çalışmada CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak H. armigera’da gen nakavtını tamamlamak için adım adım sistematik bir yöntem sunuyoruz. Kılavuz RNA’nın (gRNA) tasarımı ve sentezi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Daha sonra kılavuz RNA (gRNA) oluşturma, embriyo toplama, mikroenjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tespiti için gene özgü astar tasarımından oluşan sonraki adımlar özetlenmiştir. Son olarak, gen düzenlemenin verimliliğini artırmak için sorun giderme önerileri ve notları sağlanır. Yöntemimiz, CRISPR/Cas9 genom düzenlemenin H. armigera’da ve diğer Lepidopteran güvelerinde uygulanması için bir referans görevi görecektir.

Introduction

Genom düzenleme teknolojisinin uygulanması, çeşitli türlerde hedef gen mutantlarına ulaşmak için etkili bir araç sağlar. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarların (CRISPR)/ilişkili protein 9 (Cas9) sisteminin ortaya çıkması genomları manipüle etmek için yeni bir yöntem sağlar1. CRISPR/Cas9 sistemi bir kılavuz RNA (gRNA) ve Cas9 endonuclease2,3’den oluşurken, gRNA iki bölüme ayrılabilir, hedef tamamlayıcı CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici crRNA (tracrRNA). gRNA, Cas9 endonucleaz ile entegredir ve ribonikleoprotein (RNP) oluşturur. gRNA ile Cas9 endonucleaz, baz tamamlayıcısı yoluyla genomun belirli bir bölgesine yönlendirilebilir. Cas9’un RuvC ve HNH etki alanları, protospacer bitişik motif (PAM) dizisinden önce genomun hedef bölgesini üç temele ayırır ve çift iplikçikli bir mola (DSB) oluşturur. DNA bölünmesi daha sonra homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR)4 olmak üzere iki mekanizma ile onarılabilir. DSB’nin onarımı, hedeflenen geni devre dışı bırakmanın bir yolu olarak eklemeleri veya silmeleri tanıtır ve potansiyel olarak gen fonksiyonunun tamamen kaybına neden olur. Bu nedenle, CRISPR/Cas9 sisteminin sapkınlığı ve özgüllüğü, gen fonksiyonlarını in vivo olarak karakterize etmek ve gen etkileşimlerini analiz etmek için sağlam bir yöntem haline getirir5.

Crispr/Cas9 sistemi, biyotıp6,7, gen tedavisi8,9 ve tarım10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli alanlara uygulanmıştır ve mikroorganizmalar13, bitkiler14,15, nematodlar16 ve memeliler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemler için kullanılmıştır17 . Omurgasızlarda, meyve sineği Drosophila melanogaster ve 18,19,20,21,22 ötesi gibi birçok böcek türü CRISPR / Cas9 genom düzenlemesine tabi tutulmuştur.

Helicoverpa armigera dünya çapında en yıkıcı zararlılardan biridir23 ve pamuk, soya fasulyesi ve sorgum24,25 dahil olmak üzere çok sayıda ürüne zarar verir. Sıralama teknolojisinin gelişmesiyle, H. armigera’nın genomunun yanı sıra bir dizi Lepidoptera böcek türünün genomları tamamen sıralanmıştır26,27,28,29. Son yıllarda bu böceklerden çok sayıda direnç ve koku reseptör geni tanımlanmış ve karakterize edilmiştir19,27,28,29. H. armigera’da cadherin30, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı31,32 ve HaTSPAN133 için kodlanan genler gibi dirençle ilgili bazı genler tanımlanmıştır. CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak bu genlerin nakavtı, hassas suşlarda Bacillus thuringiensis (BT) toksinine karşı yüksek düzeyde dirençle sonuçlanır. Ayrıca, Chang ve arkadaşları (2017), çiftleşme süresi düzenlemesinde önemli işlevini doğrulayan bir feromon reseptörü devirdi19. Bu raporlar CRISPR/Cas9’un böcek sistemlerinde in vivo gen fonksiyonunu incelemek için etkili bir araç olarak işlev görebildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, böcek sistemlerinde CRISPR / Cas9 modifikasyonu için ayrıntılı bir prosedür eksik kalır, bu da böcek fonksiyonel genomiklerinde uygulama aralığını sınırlar.

Burada, CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak H. armigera’daki fonksiyonel bir geni yok etmek için bir protokol sunuyoruz. GRNA üretimi, embriyo toplama, mikroenjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tanımlama için gen spesifik astarların tasarımı ve hazırlanması dahil olmak üzere ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, H. armigera’daki herhangi bir fonksiyonel geni manipüle etmek için değerli bir referans görevi görür ve diğer Lepidoptera türlerine genişletilebilir.

Protocol

1. Genlere özgü astarların tasarımı ve sgRNA’nın hazırlanması PCR amplifikasyonu ve dizileme analizleri ile ilgi geninde korunmuş bir genomik bölgeyi doğrulayın. Hedef geni H. armigera’nın genom DNA’sından yükseltin ve eksonları ve intronları ayırt edin.NOT: Hedef dışı gen düzenlemesini önlemek için kılavuz sitesinin sıra özgüllüğü gereklidir. Eksonlardaki olası kılavuz bölgeleri arama, genin 5′ UTR’sine yakındır. Daha sonra, genin tamamen işlevsiz olduğundan e…

Representative Results

Bu protokol, CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanarak H. armigera’nın gen nakavt hatlarını elde etmek için ayrıntılı adımlar sağlar. Bu protokol ile elde edilen temsili sonuçlar gDNA seçimi, embriyo toplama ve enjeksiyon, böcek yetiştirme ve mutant tespiti için özetlenmiştir. Bu çalışmada, ilgi genimizin hedef bölgesi ikinci eksonunda yer meydana geldi (Şekil 2A). Bu bölge…

Discussion

CRISPR/Cas9 sisteminin uygulanması, gen fonksiyonunun ve çeşitli genler arasındaki etkileşimin analizi için güçlü teknik destek sağlamıştır. Burada sunduğumuz ayrıntılı protokol, CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi ile H. armigera’da homozigot mutantının neslini göstermektedir. Bu güvenilir prosedür, H. armigera’da yönlendirilmiş gen mutajenisi için basit bir yol sağlar.

CRISPR hedef sahalarının seçimi mutajensis verimliliğini etkile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (gw 31861133019 31725023 ve CY için 31171912) tarafından desteklendi.

Materials

2kb DNA ladder TransGen Biotech BM101
Capillary Glass World Precision Instrucments 504949 referred to as "capillary glass" in the protocol
Double Sided Tape Minnesota Mining and Manufacturing Corporation 665
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector Eppendorf Corporate E5252000021
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf Corporate 5192000051
Eppendorf Microloader Pipette Tips Eppendorf Corporate G2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Microscope Slide Sail Brand 7105
Olympus Microscope Olympus Corporation SZX16
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040 used for mutant detection
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Company P-1000
TIANamp Genomic DNA Kit TIANGEN Corporate DP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36499

References

  1. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  5. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  6. Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
  7. Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
  8. Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
  9. Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
  10. Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
  11. Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
  12. Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
  13. Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
  14. Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
  15. Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
  16. Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  17. Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
  18. Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
  19. Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
  20. Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
  21. Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
  22. Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
  23. Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
  24. Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
  25. Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
  26. Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  27. Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
  28. Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
  29. Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
  30. Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
  31. Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
  32. Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
  33. Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
  34. Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
  35. Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
  36. Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
  37. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
  38. Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
  39. Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
  40. Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
  41. Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
check_url/kr/62068?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Ai, D., Wang, B., Fan, Z., Fu, Y., Yu, C., Wang, G. Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner). J. Vis. Exp. (173), e62068, doi:10.3791/62068 (2021).

View Video