Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação
Summary
Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.
Abstract
A somitogênese é uma marca registrada do desenvolvimento embrionário vertebrado. Há anos, pesquisadores vêm estudando esse processo em uma variedade de organismos usando uma ampla gama de técnicas que englobam abordagens ex vivo e in vitro. No entanto, a maioria dos estudos ainda se baseia na análise de dados bidimensionais (2D) de imagem, que limita a avaliação adequada de um processo de desenvolvimento como extensão axial e somitogênese envolvendo interações altamente dinâmicas em um complexo espaço 3D. Aqui descrevemos técnicas que permitem a aquisição de imagens ao vivo do mouse, processamento de conjunto de dados, visualização e análise em 3D e 4D para estudar as células (por exemplo, progenitoras neuromesodérmicas) envolvidas nesses processos de desenvolvimento. Também fornecemos um protocolo passo-a-passo para tomografia de projeção óptica e microscopia de imunofluorescência de montagem total em embriões de camundongos (da preparação da amostra à aquisição de imagens) e mostramos um pipeline que desenvolvemos para processar e visualizar dados de imagem 3D. Estendemos o uso de algumas dessas técnicas e destacamos características específicas de diferentes softwares disponíveis (por exemplo, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que podem ser usados para melhorar nossa compreensão atual da extensão axial e da formação de somite (por exemplo, reconstruções 3D). Ao todo, as técnicas aqui descritas enfatizam a importância da visualização e análise de dados 3D na biologia do desenvolvimento, e podem ajudar outros pesquisadores a abordar melhor os dados de imagem 3D e 4D no contexto de extensão e segmentação axial vertebrados. Por fim, o trabalho também emprega novas ferramentas para facilitar o ensino do desenvolvimento embrionário dos vertebrados.
Introduction
A formação do eixo do corpo vertebrado é um processo altamente complexo e dinâmico que ocorre durante o desenvolvimento embrionário. No final da gastruição [no camundongo, em torno do dia embrionário (E) 8.0], um grupo de células progenitoras epiblastos conhecidas como progenitores neuromesodérmicos (NMPs) tornam-se um driver chave de extensão axial em uma sequência cabeça a cauda, gerando o tubo neural e tecidos mesodérmicos paraxial durante a formação do pescoço, tronco e cauda 1,2,3,4 . Curiosamente, a posição que esses NMPs ocupam no epiblasto caudal parece desempenhar um papel fundamental na decisão de diferenciar-se em mesoderme ou neuroectoderme5. Embora atualmente não tenhamos uma impressão digital molecular precisa para NMPs, essas células são geralmente pensadas para co-expressar T (Brachyury) e Sox2 5,6. Os mecanismos exatos que regulam as decisões de destino do NMP (ou seja, se tomam rotas neurais ou mesodérmicas) estão apenas começando a ser precisamente definidos. A expressão tbx6 na região primitiva é um marcador inicial da decisão de destino NMP, pois este gene está envolvido na indução e especificação do mesoderme 6,7. Curiosamente, as primeiras células de mesoderme parecem expressar altos níveis de Epha18, e sinalização Wnt/β-catenin, bem como Msgn1 também foram mostrados para desempenhar papéis importantes na diferenciação paraxial de mesoderme e formação de somite 9,10. Uma análise espacial-temporal completa dos NMPs a um nível unicelular certamente será fundamental para entender completamente os mecanismos moleculares que controlam a especificação do mesoderme.
A formação de somites (precursores de vértebras) é uma característica fundamental dos vertebrados. Durante o alongamento axial, o mesoderme paraxial torna-se segmentado em uma série de unidades bilaterais repetitivas conhecidas como somites. O número de somites e o tempo necessário para a formação de novos segmentos variam entre as espécies11,12. A somitogênese envolve oscilações periódicas de sinalização (conhecidas como “relógio de segmentação”) que podem ser observadas pela expressão cíclica de vários genes das vias de sinalização Notch, Wnt e Fgf no mesoderme presomático (por exemplo, Lfng)11,12. O modelo atual de somitogênese também postula a existência de uma “frente de onda de maturação”, uma série de gradientes de sinalização complexos envolvendo fgf, Wnt e sinal de ácido retinóico que definem a posição da borda posterior de cada novo somite. Uma interação coordenada entre o “relógio de segmentação” e a “frente de onda de maturação” é, portanto, fundamental para a geração desses módulos precursores de vértebras, pois perturbações nesses principais processos morfogenéticos podem resultar em letalidade embrionária ou na formação de malformações congênitas (por exemplo, escoliose)13,14,15.
Apesar dos avanços recentes substanciais em técnicas de imagem, métodos de análise de bioimagem e software, a maioria dos estudos de alongamento axial e somitogênese ainda dependem de dados de imagem bidimensionais únicos/isolados (por exemplo, seções), o que não permite uma visualização completa do tecido multidimensional e complica a clara diferenciação entre malformações patológicas (ou seja, devido a mutações) versus variação morfológica normal ocorrendo durante o desenvolvimento embrionário16 . A imagem em 3D já descobriu novos movimentos morfogenéticos, anteriormente não identificados pelos métodos 2D padrão 17,18,19,20, destacando o poder do into imaging para entender os mecanismos da somitogênese vertebrado e extensão axial.
A microscopia 3D e 4D de embriões de camundongos, particularmente imagens vivas, são tecnicamente desafiadoras e requerem passos críticos durante a preparação da amostra, aquisição de imagens e pré-processamento de dados, a fim de permitir uma análise espátula-temporal precisa e significativa. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para imagens ao vivo e coloração de imunofluorescência de montagem total de embriões de camundongos, que podem ser usados para estudar tanto NMPs quanto células mesodérmicas durante a extensão e segmentação axiais. Além disso, descrevemos também um protocolo para tomografia de projeção óptica (OPT) de embriões e fetos mais antigos, que permite a visualização 3D em toto e quantificação de anormalidades patológicas que podem resultar de problemas durante a somitogênese (por exemplo, fusão óssea e escoliose)13,21,22. Por fim, ilustramos o poder das reconstruções de imagens 3D no estudo e ensino da segmentação de vertebrados e alongamento axial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alongamento axial e segmentação são dois dos processos mais complexos e dinâmicos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário vertebrado. O uso de imagens 3D e 4D com rastreamento unicelular tem sido aplicado, há algum tempo, para estudar esses processos tanto em embriões de zebrafish quanto de frango, para os quais as condições de acessibilidade e cultura facilitam imagens complexas 19,44,45,46,47,48,49</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Olivier Pourquié e Alexander Aulehla pela estirpe repórter da LuVeLu, o laboratório SunJin para a amostra de teste RapiClear, Hugo Pereira pela ajuda usando o BigStitcher, Nuno Granjeiro para ajudar a montar o aparelho de imagem ao vivo, a instalação animal do IGC e membros passados e presentes do laboratório Mallo para comentários e apoio úteis durante este trabalho.
Agradecemos o apoio técnico do Advanced Imaging Facility da IGC, que é apoiado pelo ref de financiamento português# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, co-financiado pelo Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), no âmbito do Acordo de Parceria Portugal 2020, por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado por subvenções LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) e SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) a M.M., a infraestrutura de pesquisa Congento, o projeto LISBOA-01-0145-FEDER-022170 e a bolsa de doutorado PD/BD/128426/2017 para A.D.
Materials
| Agarose low gelling temperature | Sigma | A9414 | Used to mounting embryos (e.g. for OPT) |
| Amira software | Thermofisher | – | Commerial software tool |
| Anti-Brachyury (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF2085 RRID:AB_2200235 | For immunofluorescence |
| Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal) | Abcam | ab92494 RRID:AB_10585428 | For immunofluorescence |
| Anti-Tbx6 (Goat polyclonal) | R and D Systems | AF4744 RRID:AB_2200834 | For immunofluorescence |
| Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal) | Sigma | L9393 RRID:AB_477163 | For immunofluorescence |
| Anti-goat 488 (Donkey polyclonal) | Molecular Probes | A11055 RRID:AB_2534102 | For immunofluorescence |
| Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal) | ThermoFisher Scientific | A10042 RRID:AB_2534017 | For immunofluorescence |
| Benzyl Alcohol (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Benzyl Benzoate (99+%) | (any) | – | Used to clear embryos (component of BABB) |
| Bovine serum albumin | Biowest | P6154 | For immunofluorescence |
| Coverglass 20×20 mm #0 | (any) | – | 100um thick |
| Coverglass 20×20 mm #1 | (any) | – | 170um thick |
| Coverglass 20×60 mm #1.5 | (any) | – | To use as “slides” |
| DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride) | Life Technologies | D3571 | For immunofluorescence |
| Drishti software | (open source) | – | Free software tool |
| EDTA | Sigma | ED2SS | For demineralization |
| Fiji/ImageJ software | (open source) | – | Free software tool |
| Glycine | NZYtech | MB01401 | For immunofluorescence |
| Huygens software | Scientific Volume Imaging | – | Commerial software tool |
| HyClone defined fetal bovine serum | GE Healthcare | #HYCLSH30070.03 | For live imaging |
| Hydrogen peroxide solution 30 % | Milipore | 1085971000 | For clearing |
| Imaris software | Bitplane / Oxford instruments | – | Commerial software tool |
| iSpacers | SunJin Lab | (varies) | Use as spacers for preparations |
| L-glutamine | Gibco | #25030–024 | For live imaging medium |
| Low glucose DMEM | Gibco | 11054020 | For live imaging medium |
| M2 medium | Sigma | M7167 | To dissect embryos |
| Methanol | VWR | VWRC20847.307 | For dehydration and rehydration steps |
| Methyl salicylate | Sigma | M6752 | Used to clear embryos |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Used in solution to fix embryos |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | #P0781 | For live imaging medium |
| PBS (Phosphate-buffered saline solution) | Biowest | L0615-500 | – |
| RapiClear | SunJin Laboratory | RapiClear 1.52 | Used to clear embryos |
| Secure-Sea hybridization chambers | Sigma | C5474 | Use as spacers for preparations |
| simLab software | SimLab soft | – | Commerial software tool |
| Slide, depression concave glass – 75×25 mm | (any) | – | To mount thick embryos. |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | For immunofluorescence |
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