여기서 우리는 호핑 프로브 이온 전도 현미경 검사법 (HPICM)에 대한 프로토콜을 제시, 라이브 청각 헤어 셀에서 스테레오실리의 나노 스케일 이미징을 허용하는 비 접촉 스캐닝 프로브 기술.
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이 논문에서
요약
초록
내이 헤어 셀은 소리 유발 변위를 감지하고 높이가 증가하는 행으로 배열되는 스테레오실리아로 구성된 헤어 번들에서 이러한 자극을 전기 신호로 변환합니다. 스테레오실리아가 편향되면 작은(직경5nm)에 예인선이 교차하는 스테레오시리아를 연결하여 메카노감과감성 트랜스듀션 채널에 힘을 전달합니다. 메카노트랜스덕션은 수십 년 동안 살아있는 모발 세포에서 연구되었지만, 스테레오실리아 의 끝에서 메카노트랜스덕션 기계의 기능적으로 중요한 초구조적 세부 사항(예: 팁 링크 역학 또는 트랜스듀션 의존성 입체 리모델링)은 여전히 전자 현미경 검사를 받은 죽은 세포에서만 연구될 수 있다. 이론적으로, 원자력 현미경 검사법과 같은 스캐닝 프로브 기술은 스테레오실리아의 표면을 시각화하기에 충분한 해상도를 갖습니다. 그러나, 이미징 모드와는 별개로, 스테레오실리와 함께 원자력 현미경 프로브의 사소한 접촉조차도 일반적으로 번들을 손상시합니다. 여기서 우리는 살아있는 설치류 청각 모발 세포의 호핑 프로브 이온 전도성 현미경 검사법 (HPICM) 화상 진찰에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비접촉 스캐닝 프로브 기술은 모발 세포와 같은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포의 표면의 시간 경과 이미징을 단일 나노미터 해상도로 샘플과 물리적접촉을 하지 않고도 할 수 있습니다. HPICM은 유리 나노피펫을 통과하는 전류를 사용하여 파이펫 가까이에서 셀 표면을 감지하고 3D 포지셔닝 압전 시스템은 표면을 스캔하고 이미지를 생성합니다. HPICM을 사용하면 눈에 띄는 손상없이 몇 시간 동안 살아있는 청각 헤어 셀에서 스테레오실리아를 상호 연결하는 스테레오실리와 연결 된 링크를 이미지 할 수있었습니다. 우리는 HPICM의 사용이 그들의 기능을 더 잘 이해하기 위해 살아있는 머리 세포의 스테레오실리에 있는 초구조적인 변경의 직접적인 탐구를 허용할 것으로 예상합니다.
서론
청각 모발 세포내 의 스테레오실리아가 광학 현미경 검사법에 의해 시각화되고 패치 클램프 실험에서 살아있는 세포에서 편향될 정도로 크다는 사실에도 불구하고 팁 링크와 같은 트랜스듀션 기계의 필수 구조 성분은 죽은 세포에서전자 현미경으로만 이미지화될 수 있다. 포유류 청각 모발 세포에서, 트랜스듀션 기계는 팁 링크의 하부 에 위치하고, 즉, 짧은 행 스테레오실리아1의 끝에서 스테레오실리아2의끝에서 신호를 통해 국소적으로조절된다 2,3. 그러나, 살아있는 머리 세포에 있는 이 위치에 있는 표면 구조물의 레이블 없는 화상 진찰은 입체증의 작은 크기 때문에 가능하지 않습니다.
포유류 달팽이관에는 두 가지 유형의 청각 감각 세포가 있습니다: 내부 및 외부 모발 세포. 내부 모발 세포에서, 스테레오실리아는 외발성 세포4에비해 더 길고 두껍다. 스테레오실리아의 첫 번째 및 두 번째 행은 마우스 또는 쥐 내부 모발 세포에서 300-500 nm의 직경을 갖는다. 빛의 회절로 인해 라벨이 없는 광학 현미경으로 달성할 수 있는 최대 해상도는 약 200nm입니다. 따라서, 내부....
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프로토콜
연구 결과는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 있는 권고에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 00903M2005).
1. 나노 피펫제조 및 테스트
- 마이크로피펫 풀러에 프로그램을 만들어 약 50-70 nm의 내부 팁 직경에 해당하는 200MΩ에서 400 MΩ 사이의 저항을 가진 파이펫을 얻습니다. 매개 변수는 마이크로 피펫 풀러에 따라 달라집니다. 유연한 미세 팁이 없는 짧은 파이펫을 얻으려면 풀러의 작동 매뉴얼을 체크 인하십시오.
- 1/0.58mm의 외부/내지 직경의 보로실리케이트 유리 모세혈관과 내부 필라멘트를 사용하여 충전을 용이하게 합니다. 파이펫의 측면 기계적 공명 빈도를 결정하기 때문에 파이펫의 길이가 중요합니다. 파이펫이 길수록 공진 주파수가 낮아지고 이 공명을 피하기가 더 어려워집니다.
참고: 사용자는 홀더가 수락할 수 있는 가장 짧은 파이펫을 제조해야 합니다. 이 실험에서 나노피펫의 길이는 일반적으로 15-25mm(도 2A)이다. - 나노피펫을 중간 지점(그림
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결과
이 논문에 제시된 프로토콜은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 단계에 따라, 우리는 일상적으로 살아있는 쥐 청각 머리 세포 번들의 이미지를 얻을 수 있습니다(그림 6B,D). SEM 이미지와 비교할 때 X-Y 해상도가 낮음에도 불구하고, 우리의 HPICM 이미지는 입체화의 다른 행, 스테레오실리아 팁의 모양, 심지어 인접한 스테레오실리아(도 6F)를연결하는 작은 링크 (직경 5 nm)를 성공적으로 해결할 수 있습니다. 또한 HPICM 이미지는 SEM 이미지가 부족하다는 정보를 3D로 가지고 있습니다. 이러한 유형의 이미징 기술의 비접촉 특성을 감안할 때, 우리는 또한 번들 응집력을 손상시키지 않고 몇 시간 동안 동일한 헤어 셀 번들의 연속 타임랩스 HPICM 이미징(예: 5-6 h)을 수행할 수있었다(도 7).<.......
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토론
성공적인 HPICM 이미지를 얻으려면 사용자는 낮은 소음과 낮은 진동 시스템을 구축하고 적절한 파이펫을 제조해야합니다. 우리는 강력하게 어떤 라이브 세포 이미징을 수행하기 전에 시스템의 안정성을 테스트하기 위해 AFM 교정 표준의 사용을 권장합니다. 시스템의 해상도가 테스트되면 사용자는 라이브 셀 이미징을 시도하기 전에 이미징 설정에 익숙해지기 위해 Corti 샘플의 고정 기관을 이미징하는 것을 고려할 수 있습니다.
이미징을 위한 최적의 설정점은 팁의 개별 모양(전자 현미경 검사에 의해 검사될 때까지 알려지지 않음)과 팁에 부착된 먼지의 양에 따라 다른 파이펫마다 다양하며, 이는 예측할 수 없습니다. 최적의 설정점을 0.7% 이상 인 나노피펫은 폐기해야 합니다.
살아있는 세포의 화상 진찰 도중, 세포외 용액에 있는 먼지그리고 파편의 양은 시간이 지남에 따라 증가합니다. 이러한 모든 입자는 파이펫 의 끝에서 끝날 수 있습니다, 전류.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 이해관계가 없습니다.
감사의 글
프로젝트의 모든 단계에서 장기적인 지원과 조언을 해주신 유리 코르체프 교수(영국 임페리얼 칼리지)에게 감사드립니다. 또한 파벨 노박 박사와 앤드류 셰브추크 박사(영국 임페리얼 칼리지)와 올렉 벨로프(러시아 국립청각연구센터)에게 소프트웨어 개발에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 NIDCD/NIH(R01 DC008861 및 R01 DC014658에서 G.I.F.까지)에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아날로그 오실로스코프 | B& 나 | 노 피펫 전류 및 Z축 접근 방식의 실시간 모니터링을 위한 | 2160C |
| AFM 교정 표준 | TED PELLA Inc | HS-100MG; HS-20MG | 이 100 및 20nm 교정 표준은 HPICM 시스템 |
| 벤치탑 진동 절연체, | AMETEK/TMC | Everstill K-400 | 활성 진동 절연 |
| 붕규산 유리 모세관, | World Precision Instruments(WPI) | 1B100F-4 | 나노피펫용 붕규산 유리 모세관, |
| D-(+)-포도 | Sigma-Aldrich | G8270 | 의 성능을 테스트하는 데 사용됩니다.삼투압 디 |
| 지타이저 | National Instruments Corporation | PCI-6221 | 다중 채널 입력/출력 디지타이저 |
| Z 이동을 위한 고속 아날로그 비례-적분-미분(PID) 제어 | Standford Research Systems | SIM900, SIM960, SIM980 | Z 이동을 위한 외부 PID 컨트롤러에 통합된 계측 모듈. 일반적으로 상용 피에조 증폭기에서 구현되지 않는 빠른 응답이 필요합니다. |
| 패러데이 케이지 | AMETEK/TMC | Type II | 전자기 간섭을 차폐하는 데 필요 |
| 유리 바닥 접시 | WPI(World Precision Instruments) | FD5040-100 | 조직의 챔버용 접시로 사용 |
| Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14025092 | 세포외(수조) 용액 |
| 계측 증폭기 | Brownlee Precision | Model 440 | 계측 증폭기는 필요한 오프셋, 필터링 및 2차 배율 또는 감쇠를 제공합니다 |
| 레이저 기반 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument | P-2000/G | 마이크로피펫 풀러. 날카로운 석영 피펫에는 레이저가 필요합니다. |
| Lebovitz의 L-15, 페놀 레드 | 없음 Gibco, Thermo Fisher Scientific | 21083027 | 세포외(수조) 솔루션 |
| Micromanipulator | Scientifica PatchStar | Z 피에조 액추에이터의 "코스" 포지셔닝에 사용 | |
| 현미경 | Nikon | Eclipse TS100 | 도립 광학 현미경 |
| 패치 증폭기 | Molecular Devices | Axopatch 200B | 패치 클램프 증폭기는 나노 피펫 |
| 피에조 증폭기 (XY 축) | Physik Instrumente (PI) | E-500.00, E-505.00, E-509를 통해 전류를 측정합니다. | XY 피에조 변환 단계를 위한 C2A 증폭 및 PID 제어 |
| 피에조 증폭기 (Z 축) | 피에조 시스템 jena | ENT 400 & 800 | 사용자 정의 앰프는 ENT 400 전원 공급 장치와 두 개의 ENT 800 증폭기를 병렬로 연결하여 최대 전류 1.6 nA를 달성합니다 |
| . 플라스틱 커버슬립 | TED PELLA Inc | 26028 | 조직용 챔버 제작에 사용됩니다. |
| SICM 컨트롤러 및 소프트웨어* | Ionscope, UK (ionscope.com) | N/A | Innovative Integration Ltd의 SBC6711 디지털 신호 처리 보드를 기반으로 한 맞춤형 컨트롤러 |
| 실리콘 엘라스토머(Sylgard) | World Precision Instruments(WPI) | SYLG184 | 의 챔버에 유연한 유리 섬유를 부착하는 데 사용 |
| The | Dow Chemical Company | 734 | 조직 용 챔버의 다른 부분을 접착하는 데 사용됩니다 |
| 텅스텐 막대 | A-M Systems | 717500 | 실 가닥을 고정하는 데 사용됩니다 |
| 피에조 나노 포지셔너 | 피에조 시스템 예나 | RA 12/24 SG | 스트레인 게이지 센서가 있는 링 피에조 액추에이터 |
| *Ionscope는 더 이상 별도의 SICM 컨트롤러를 판매하지 않습니다. 다른 상용 시스템은 거의 없습니다. NX12-Bio 및 NX10 SICM, | |||
| Park Systems, 한국 및 영국 ICAPPIC Limited의 SICM 모듈(icappic.com). 이 모든 시스템은 원본을 기반으로 합니다 | |||
| HPICM 원칙. 그러나, 유모 세포에서 입체섬모 다발을 이미징하는 것은 기술적으로 다음과 같은 몇 가지 맞춤형 수정을 필요로 합니다. | |||
| 닫힌 곳에서 도전적인(또는 심지어 불가능한) " 바로 사용할 수 있습니다." Ionscope 또는 NX12-Bio/NX10과 같은 시스템. 현재는 하나뿐입니다 | |||
| 모든 SICM/HPICM 실험에 적합할 수 있는 유연성을 제공하지만 일부 구성 요소 통합이 필요한 모듈식 시스템(ICAPPIC)입니다. |
참고문헌
- Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging. Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).
- Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J.
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재인쇄 및 허가
