मज़बूती से इंजीनियरिंग और स्तनधारी कोशिकाओं में स्थिर ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को नियंत्रित करना
Summary
मज़बूती से प्रकाश-उत्तरदायी स्तनधारी कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक तरीकों के मानकीकरण की आवश्यकता होती है। इस लक्ष्य की ओर, यह अध्ययन जीन सर्किट निर्माण, सेल इंजीनियरिंग, ऑप्टोजेनेटिक उपकरण संचालन, और सत्यापन assays की एक पाइपलाइन को रेखांकित करता है ताकि एक मामले के अध्ययन के रूप में नकारात्मक-प्रतिक्रिया ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट का उपयोग करके प्रकाश-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन को मानकीकृत किया जा सके।
Abstract
स्तनधारी कोशिकाओं में विश्वसनीय जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए उच्च गुना परिवर्तन, कम शोर और निर्धारित इनपुट-टू-आउटपुट ट्रांसफर फ़ंक्शंस वाले उपकरणों की आवश्यकता होती है, भले ही उपयोग की गई विधि की परवाह किए बिना। इस लक्ष्य की ओर, ऑप्टोजेनेटिक जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों ने स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन के स्तर के स्पैटिओटेम्पोरल नियंत्रण के लिए पिछले दशक में बहुत ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, प्रकाश-प्रेरित जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले अधिकांश मौजूदा सर्किट वास्तुकला में भिन्न होते हैं, प्लास्मिड से व्यक्त किए जाते हैं, और चर ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का उपयोग करते हैं, जिससे स्थिर सेल लाइनों में ऑप्टोजेनेटिक घटकों के लक्षण वर्णन और मानकीकरण का पता लगाने की आवश्यकता होती है। यहां, अध्ययन स्तनधारी कोशिकाओं में प्रकाश-अपरिवर्तनीय जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए विश्वसनीय जीन सर्किट निर्माण, एकीकरण और लक्षण वर्णन की एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन प्रदान करता है, एक मामले के उदाहरण के रूप में एक नकारात्मक प्रतिक्रिया ऑप्टोजेनेटिक सर्किट का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल यह भी बताते हैं कि ऑप्टोजेनेटिक उपकरण और प्रकाश शासनों को मानकीकृत करने से जीन अभिव्यक्ति शोर और प्रोटीन अभिव्यक्ति परिमाण जैसी जीन सर्किट विशेषताओं को मज़बूती से प्रकट किया जा सकता है। अंत में, यह पेपर ऑप्टोजेनेटिक्स से अपरिचित प्रयोगशालाओं के लिए उपयोग का हो सकता है जो इस तरह की तकनीक को अपनाना चाहते हैं। यहां वर्णित पाइपलाइन को स्तनधारी कोशिकाओं में अन्य ऑप्टोजेनेटिक सर्किट के लिए लागू होना चाहिए, जिससे स्तनधारी कोशिकाओं में ट्रांसक्रिप्शनल, प्रोटिओमिक और अंततः फेनोटाइपिक स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के अधिक विश्वसनीय, विस्तृत लक्षण वर्णन और नियंत्रण की अनुमति मिलती है।
Introduction
अन्य इंजीनियरिंग विषयों के समान, सिंथेटिक जीव विज्ञान का उद्देश्य प्रोटोकॉल को मानकीकृत करना है, जिससे जैविक प्रणालियों से संबंधित प्रश्नों की खोज के लिए अत्यधिक पुनरुत्पादक कार्यों वाले उपकरणों का उपयोग किया जा सकता है1,2। सिंथेटिक जीव विज्ञान में एक डोमेन जहां कई नियंत्रण प्रणालियों का निर्माण किया गया है, जीन अभिव्यक्ति विनियमन 3,4 का क्षेत्र है। जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण प्रोटीन के स्तर और परिवर्तनशीलता दोनों को लक्षित कर सकता है (शोर या भिन्नता का गुणांक, सीवी = σ / μ, माध्य पर मानक विचलन के रूप में मापा जाता है), जो शारीरिक और पैथोलॉजिकल सेलुलर राज्यों में उनकी भूमिकाओं के कारण महत्वपूर्ण सेलुलर विशेषताएं हैं5,6,7,8। कई सिंथेटिक सिस्टम जो प्रोटीन के स्तर और शोर को नियंत्रित कर सकते हैं4,9,10,11,12 को इंजीनियर किया गया है, जिससे उपकरणों में प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने के अवसर पैदा होते हैं।
उपकरणों का एक उपन्यास सेट जो जीन नेटवर्क को नियंत्रित कर सकता है जो हाल ही में उभरा है वह ऑप्टोजेनेटिक्स है, जो जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश के उपयोग को सक्षम करता है13,14,15,16,17। उनके रासायनिक पूर्ववर्तियों के समान, ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट को किसी भी सेल प्रकार में पेश किया जा सकता है, जिसमें बैक्टीरिया से लेकर स्तनधारियों तक शामिल हैं, जिससे ब्याज के किसी भी डाउनस्ट्रीम जीन की अभिव्यक्ति की अनुमति मिलती है18,19। हालांकि, उपन्यास ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों की तेजी से पीढ़ी के कारण, कई प्रणालियां उभरी हैं जो आनुवंशिक सर्किट आर्किटेक्चर, अभिव्यक्ति के तंत्र (जैसे, प्लास्मिड-आधारित बनाम वायरल एकीकरण) और प्रकाश आपूर्ति नियंत्रण उपकरण11,16,20,21,22,23,24,25 में भिन्न होती हैं . इसलिए, यह जीन सर्किट निर्माण और अनुकूलन, सिस्टम उपयोग की विधि (जैसे, एकीकरण बनाम क्षणिक अभिव्यक्ति), प्रेरण के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक उपकरण, और परिणामों के विश्लेषण जैसी ऑप्टोजेनेटिक विशेषताओं के मानकीकरण के लिए जगह छोड़ देता है।
स्तनधारी कोशिकाओं में ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल के मानकीकरण पर प्रगति करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में एचईके 293 कोशिकाओं (मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिका रेखा) में एकीकृत नकारात्मक प्रतिक्रिया (एनएफ) जीन सर्किट का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं में ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को इंजीनियर करने के लिए एक प्रयोगात्मक पाइपलाइन का वर्णन करता है। NF मानकीकरण का प्रदर्शन करने के लिए एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि यह प्रकृति में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में 26,27,28 है, जिससे प्रोटीन के स्तर को ट्यून किया जा सकता है और शोर न्यूनीकरण होने की अनुमति मिलती है। संक्षेप में, एनएफ एक दमनकारी द्वारा सटीक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए अपनी अभिव्यक्ति को पर्याप्त रूप से तेजी से कम करने की अनुमति देता है, जिससे किसी भी परिवर्तन को स्थिर स्थिति से दूर सीमित किया जा सकता है। स्थिर स्थिति को एक प्रेरक द्वारा बदला जा सकता है जो दमनकारी को निष्क्रिय या समाप्त कर देता है ताकि अधिक प्रोटीन उत्पादन की अनुमति दी जा सके जब तक कि प्रत्येक प्रेरक एकाग्रता के लिए एक नई स्थिर स्थिति तक नहीं पहुंच जाती है। हाल ही में, एक इंजीनियर एनएफ ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम बनाया गया था जो जीन अभिव्यक्ति की एक व्यापक गतिशील प्रतिक्रिया का उत्पादन कर सकता है, कम शोर बनाए रख सकता है, और स्थानिक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण 11 की क्षमता की अनुमति देने वाले प्रकाश उत्तेजनाओं का जवाब दे सकता है। ये उपकरण, जिन्हें लाइट-इनड्यूसिबल ट्यूनर्स (LITers) के रूप में जाना जाता है, पहले की प्रणालियों से प्रेरित थे, जिन्होंने जीवित कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की अनुमति दी 4,10,29,30 और दीर्घकालिक जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए मानव सेल लाइनों में स्थिर रूप से एकीकृत किया गया था।
यहां, एक उदाहरण के रूप में LITer का उपयोग करते हुए, प्रकाश-उत्तरदायी जीन सर्किट बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है, एक लाइट प्लेट उपकरण (एलपीए, एक ऑप्टोजेनेटिक इंडक्शन हार्डवेयर) 31 के साथ जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, और कस्टम प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए इंजीनियर, ऑप्टोजेनेटिक रूप से-नियंत्रणीय सेल लाइनों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करता है। यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को किसी भी कार्यात्मक जीन के लिए LITer उपकरणका उपयोग करने की अनुमति देता है जो वे खोजना चाहते हैं। इसे विभिन्न सर्किट आर्किटेक्चर (जैसे, सकारात्मक प्रतिक्रिया, नकारात्मक विनियमन, आदि) के साथ अन्य ऑप्टोजेनेटिक प्रणालियों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जो नीचे उल्लिखित तरीकों और ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को एकीकृत करके किया जाता है। अन्य सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल के समान, यहां उल्लिखित वीडियो रिकॉर्डिंग और ऑप्टोजेनेटिक प्रोटोकॉल को विभिन्न क्षेत्रों में एकल-सेल अध्ययनों में लागू किया जा सकता है, जिसमें कैंसर जीव विज्ञान, भ्रूण विकास और ऊतक भेदभाव तक सीमित नहीं है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख के पाठकों को ऑप्टोजेनेटिक जीन सर्किट (साथ ही साथ अन्य जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों) की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण चरणों में अंतर्दृष्टि प्राप्त हो सकती है, जिसमें 1) जीन सर्किट डिजाइन, निर्माण और सत्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम टिप्पणियों और सुझावों के लिए Balázsi प्रयोगशाला को धन्यवाद देना चाहते हैं, डॉ कार्ल पी Gerhardt और डॉ Jeffrey जे Tabor हमें पहले LPA का निर्माण करने में मदद करने के लिए, और LOV2-degron plasmids साझा करने के लिए डॉ Wilfried वेबर. इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों [R35 GM122561 और T32 GM008444] द्वारा समर्थित किया गया था; भौतिक और मात्रात्मक जीव विज्ञान के लिए लॉफर केंद्र; और एक राष्ट्रीय रक्षा विज्ञान और इंजीनियरिंग स्नातक (एनडीएसईजी) फैलोशिप। ओपन एक्सेस चार्ज के लिए फंडिंग: एनआईएच [R35 GM122561]।
लेखक योगदान: M.T.G. और G.B. ने परियोजना की कल्पना की। M.T.G., D.C., और L.G., ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया। M.T.G., D.C., L.G., और G.B. ने डेटा का विश्लेषण किया और पांडुलिपि तैयार की। G.B. और M.T.G. ने परियोजना की देखरेख की।
Materials
| 0.2 mL PCR tubes | Eppendorf | 951010006 | reagent for carrying out PCR |
| 0.25% Trypsin EDTA 1X | Thermo Fisher Scientific | MT25053CI | reagent for splitting & harvesting mammalian cells |
| 0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000020 | tool used for pipetting reactions |
| 100-1000 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 20-200 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000055 | tool used for pipetting reactions |
| 2-20 μL Adjustable Volume Pipette | Eppendorf | 3123000039 | tool used for pipetting reactions |
| 5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | reagent for flow cytometry |
| 5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V | Eppendorf | 22628113 | equipment for mammalian culture work |
| Agarose | Denville Scientific | GR140-500 | reagent for gel electrophoresis |
| Aluminum Foils for 96-well Plates | VWR® | 60941-126 | tool used for covering plates in light-induction experiments |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9518-5G | reagent for selecting bacteria with correct plasmid |
| Analog vortex mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365PR | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| Bacto Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140010 | reagent for growing bacteria |
| BD LSRAria | BD | 656700 | tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations |
| BD LSRFortessa | BD | 649225 | tool for characterizing engineered cell lines |
| BSA, Bovine Serum Albumine | Government Scientific Source | SIGA4919-1G | reagent for IF incubation buffer |
| Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC | Corning | 353043 | plate used for growing monoclonal cells |
| Centrifuge | VWR | 22628113 | instrument for mammalian cell culture |
| Chemical fume hood | N/A | N/A | instrument for carrying out IF reactions |
| Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid | BD | 353047 | plate used for growing monoclonal cells |
| CytoOne T25 filter cap TC flask | USA Scientific | CC7682-4825 | container for growing mammalian cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fischer Scientific | BP231-100 | reagent used for freezing down engineered mammalian cells |
| Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15-585-011 | reagent for gel electrophoresis |
| Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid | Corning | 353072 | container for growing sorted monoclonal cells |
| FCS Express | De Novo Software: | N/A | software for characterizing flow cytometry data |
| Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL | Corning | 35-010-CV | reagent for growing mammalian cells |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | equipment for growing bacteria |
| Gibco DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11-965-092 | reagent for growing mammalian cells |
| Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL | Life Technologies | 10687-010 | reagent for selecting cells with proper gene circuit integration |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | reagent for converting RNA to cDNA |
| Laboratory Freezer -20 °C | VWR | 76210-392 | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U74VC | equipment for storing experimental reagents |
| Laboratory Refrigerator +4 °C | VWR | 76359-220 | equipment for storing experimental reagents |
| LB Broth (Lennox) , 1 kg | Sigma-Aldrich | L3022-250G | reagent for growing bacteria |
| LIPOFECTAMINE 3000 | Life Technologies | L3000008 | reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells |
| MATLAB 2019 | MathWorks | N/A | software for analyzing experimental data |
| Methanol | Acros Organics | 413775000 | reagent for immunofluorescence reaction |
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL | VWR | 20170-333 | plasticware container |
| Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay | Life Technologies | 4331182 | qPCR Probe |
| MultiTherm Shaker | Benchmark Scientific | H5000-HC | equipment for bacterial transformation |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-NDL-US-CAN | equipment for DNA/RNA concentration measurement |
| NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix | NEB | M0492S | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs (NEB) | C3019H | bacterial cells for amplifying gene circuit of interest |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs (NEB) | E2621L | reagent for combining gene circuit fragements |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera | Nikon Instruments Inc. | N/A | instrument for quantifying gene expression |
| NIS-Elements | Nikon Instruments Inc. | N/A | software for characterizing fluorescence microscopy data |
| oligonucleotides | IDT | N/A | reagent used for PCR of gene circuit components |
| Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control | Panasonic | MCO-170AICUVHL-PA | instrument for growing mammalian cells |
| Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | reagent |
| PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) | Invitrogen | 14190144 | reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x | Fisher Scientific | 15140-122 | reagent for growing mammalian cells |
| primary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 4370S | primary ERK antibody for immunifluorescence |
| primary KRAS antibody | Sigma-Aldrich | WH0003845M1 | primary KRAS antibody for immunifluorescence |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | reagent kit for purifying gene circuit plasmids |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | reagent kit for purifying gene circuit fragments |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Eppendorf | A28137 | equipment for qRT-PCR |
| Relative Quantification App | Thermo Fisher Scientific | N/A | software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | kit for extracting RNA of engineered mammalian cells |
| Secondary ERK antibody | Cell Signaling Technology | 8889S | secondary ERK antibody for immunifluorescence |
| secondary KRAS antibody | Invitrogen | A11005 | secondary KRAS antibody for immunifluorescence |
| Serological Pipets 5.0 mL | Olympus Plastics | 12-102 | reagents used for setting up a variety of chemical reactions |
| SmartView Pro Imager System | Major Science | UVCI-1200 | tool for imaging correct PCR bands |
| SnapGene Viewer (free) or SnapGene | SnapGene | N/A | software DNA sequence design and analysis |
| Stage top incubator | Tokai Hit | INU-TIZ | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | reagent for PCR of gene circuit fragments |
| TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn | Life Technologies | 4326317E | qPCR Probe |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1851148 | tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions |
| VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated | PerkinElmer | 1450-605 | plate used for light-induction experiments |
| VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm | VWR | 14673-010 | reagent for mammalian cell culture |
| VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System | VWR | 89032-290 | equipment for DNA gel electrophoresis |
| Flp-In 293 | Thermo Fisher Scientific | R75007 | Engineered cell line with FRT site |
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