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생체공학

Engenharia confiável e controle de circuitos genéticos estáveis em células mamíferas

Published: July 06, 2021
doi:
10.3791/62109
, , ,
1Biomedical Engineering Department,Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology,Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

Summary

O controle confiável das células mamíferas responsivas à luz requer a padronização dos métodos optogenéticos. Em direção a esse objetivo, este estudo descreve um pipeline de construção de circuitos genéticos, engenharia celular, operação de equipamentos optogenéticos e ensaios de verificação para padronizar o estudo da expressão genética induzida pela luz usando um circuito genético optogenético de feedback negativo como estudo de caso.

Abstract

O controle confiável da expressão genética em células de mamíferos requer ferramentas com variação de dobra alta, baixo ruído e funções determinadas de transferência de entrada para saída, independentemente do método utilizado. Nesse sentido, os sistemas de expressão genética optogenética ganharam muita atenção na última década para o controle espacial dos níveis de proteínas em células de mamíferos. No entanto, a maioria dos circuitos existentes que controlam a expressão genética induzida pela luz variam na arquitetura, são expressos a partir de plasmídeos e utilizam equipamentos optogenéticos variáveis, criando a necessidade de explorar a caracterização e a padronização de componentes optogenéticos em linhas de células estáveis. Aqui, o estudo fornece um pipeline experimental de construção, integração e caracterização de circuitos genéticos confiáveis para controlar a expressão genética indutível de luz em células de mamíferos, usando um circuito optogenético de feedback negativo como exemplo de caso. Os protocolos também ilustram como a padronização de equipamentos optogenéticos e regimes de luz podem revelar de forma confiável características do circuito genético, como ruído de expressão genética e magnitude da expressão proteica. Por fim, este artigo pode ser útil para laboratórios não familiarizados com optogenéticas que desejam adotar tal tecnologia. O oleoduto descrito aqui deve se aplicar a outros circuitos optogenéticos em células de mamíferos, permitindo uma caracterização mais confiável e detalhada da expressão genética no nível transcricional, proteômico e, finalmente, fenotípico em células mamíferas.

Introduction

Semelhante a outras disciplinas de engenharia, a biologia sintética visa padronizar protocolos, permitindo que ferramentas com funções altamente reprodutíveis sejam utilizadas para explorar questões relevantes para sistemas biológicos1,2. Um domínio em biologia sintética onde muitos sistemas de controle foram construídos é a área de regulação da expressão genética3,4. O controle da expressão genética pode atingir tanto os níveis de proteína quanto a variabilidade (ruído ou coeficiente de variação, CV = σ/μ, medido como o desvio padrão sobre a média), que são características celulares cruciais devido aos seus papéis em estados celulares fisiológicos e patológicos5,6,7,8. Muitos sistemas sintéticos que podem controlar níveis de proteína e ruídos4,9,10,11,12 foram projetados, criando oportunidades para padronizar protocolos entre ferramentas.

Um novo conjunto de ferramentas que podem controlar redes genéticas que surgiram recentemente é a optogenética, permitindo o uso da luz para controlar a expressão genética13,14,15,16,17. Semelhante aos seus antecessores químicos, circuitos genéticos optogenéticos podem ser introduzidos em qualquer tipo de célula, desde bactérias até mamíferos, permitindo a expressão de qualquer gene a jusante de interesse18,19. No entanto, devido à rápida geração de novas ferramentas optogenéticas, muitos sistemas surgiram que variam na arquitetura do circuito genético, mecanismo de expressão (por exemplo, integração plasmida versus viral) e equipamentos de controle de fornecimento de luz11,16,20,21,22,23,24,25 . Portanto, isso abre espaço para a padronização de características optogenéticas, como construção e otimização de circuitos genéticos, método de utilização do sistema (por exemplo, integração versus expressão transitória), ferramentas experimentais utilizadas para indução e análise de resultados.

Para progredir na padronização dos protocolos optogenéticos em células de mamíferos, este protocolo descreve um pipeline experimental para projetar sistemas optogenéticos em células mamíferas usando um circuito genético de feedback negativo (NF) integrado às células HEK293 (linha de células renais embrionárias humanas) como exemplo. A NF é um sistema ideal para demonstrar padronização, uma vez que é altamente abundante 26,27,28 na natureza, permitindo que os níveis de proteína sejam ajustados e a minimização do ruído ocorra. Resumindo, a NF permite um controle preciso da expressão genética por um repressor reduzindo sua própria expressão suficientemente rápida, limitando assim qualquer mudança longe de um estado estável. O estado estável pode ser alterado por um indutor que inativa ou elimina o repressor para permitir mais produção de proteínas até que um novo estado estável seja alcançado para cada concentração indutora. Recentemente, foi criado um sistema optogenético NF projetado que pode produzir uma resposta dinâmica ampla da expressão genética, manter o baixo ruído e responder a estímulos de luz permitindo o potencial de controle de expressão genética espacial11. Essas ferramentas, conhecidas como sintonizadores indutíveis por luz (LITers), foram inspiradas por sistemas anteriores que permitiram o controle da expressão genética em células vivas4,10,29,30 e foram firmemente integradas em linhas celulares humanas para garantir o controle da expressão genética a longo prazo.

Aqui, usando o LITer como exemplo, um protocolo é delineado para a criação de circuitos genéticos responsivos à luz, induzindo a expressão genética com um aparelho de placa de luz (LPA, um hardware de indução optogenética)31, e analisar respostas das linhas celulares projetadas e optogeneticamente controláveis para estímulos de luz personalizados. Este protocolo permite que os usuários utilizem as ferramentas LITer para qualquer gene funcional que desejam explorar. Também pode ser adaptado para outros sistemas optogenéticos com diversas arquiteturas de circuito (por exemplo, feedback positivo, regulação negativa, etc.) através da integração dos métodos e equipamentos optogenéticos descritos abaixo. Semelhante a outros protocolos de biologia sintética, as gravações de vídeo e protocolos optogenéticos aqui descritos podem ser aplicados em estudos unicelulares em diversas áreas, incluindo, mas não se limitando à biologia do câncer, desenvolvimento embrionário e diferenciação de tecidos.

Protocol

1. Design do circuito genético Selecione componentes genéticos para combinar em um único circuito genético/plasmídeo (por exemplo, motivos de sequência de integração de DNA de mamíferos32, elementos responsivos à luz33 ou genes funcionais34). Usando qualquer software de engenharia genética e/ou clonagem molecular, armazene as sequências de DNA para uso e referência posteriores, anote cada sequência e examine todas as…

Representative Results

O conjunto do circuito genético e a geração de linhas de células estáveis neste artigo foram baseados em células HEK-293 comerciais e modificadas contendo um local FRT ativo transcricionalmente e único estável (Figura 1). Os circuitos genéticos foram construídos em vetores que tinham locais FRT dentro do plasmídeo, permitindo a integração Flp-FRT no genoma celular HEK-293. Essa abordagem não se limita às células Flp-In, pois os sites FRT podem ser adicionados a qualquer linha…

Discussion

Os leitores deste artigo podem obter insights sobre os passos vitais para caracterizar circuitos genéticos optogenéticos (bem como outros sistemas de expressão genética), incluindo 1) projeto de circuito genético, construção e validação; 2) engenharia celular para a introdução de circuitos genéticos em linhas celulares estáveis (por exemplo, recombinação Flp-FRT); 3) indução das células projetadas com uma plataforma baseada em luz, como a LPA; 4) caracterização inicial de ensaios de indução de luz v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer ao laboratório balázsi por comentários e sugestões, Dr. Karl P. Gerhardt e Dr. Jeffrey J. Tabor por nos ajudar a construir o primeiro LPA, e Dr. Wilfried Weber por compartilhar os plasmídeos lov2-degron. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [R35 GM122561 e T32 GM00844]; O Centro Laufer de Biologia Física e Quantitativa; e uma Bolsa de Pós-Graduação em Ciência e Engenharia de Defesa Nacional (NDSEG). Financiamento para cobrança de acesso aberto: NIH [R35 GM122561].

Contribuições autorais: M.T.G. e G.B. concebeu o projeto. M.T.G., D.C., e L.G., realizaram os experimentos. M.T.G., D.C., L.G., e G.B. analisaram os dados e prepararam o manuscrito. G.B. e M.T.G. supervisionaram o projeto.

Materials

0.2 mL PCR tubes Eppendorf 951010006 reagent for carrying out PCR
0.25% Trypsin EDTA 1X Thermo Fisher Scientific MT25053CI reagent for splitting & harvesting mammalian cells
0.5-10 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000020 tool used for pipetting reactions
100-1000 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
20-200 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000055 tool used for pipetting reactions
2-20 μL Adjustable Volume Pipette Eppendorf 3123000039 tool used for pipetting reactions
5 mL Polystyene Round-Bottom Tube w/ Cell Strainer Cap Corning 352235 reagent for flow cytometry
5702R Centrifuge, with 4 x 100 Rotor, 15 and 50 mL Adapters, 120 V Eppendorf 22628113 equipment for mammalian culture work
Agarose Denville Scientific GR140-500 reagent for gel electrophoresis
Aluminum Foils for 96-well Plates VWR® 60941-126 tool used for covering plates in light-induction experiments
Ampicillin Sigma Aldrich A9518-5G reagent for selecting bacteria with correct plasmid
Analog vortex mixer Thermo Fisher Scientific 02215365PR tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140010 reagent for growing bacteria
BD LSRAria BD 656700 tool for sorting engineered cell lines into monoclonal populations
BD LSRFortessa BD 649225 tool for characterizing engineered cell lines
BSA, Bovine Serum Albumine Government Scientific Source SIGA4919-1G reagent for IF incubation buffer
Cell Culture Plate 12-well, Clear, flat-bottom w/lid, polystyrene, non-pyrogenic, standard-TC Corning 353043 plate used for growing monoclonal cells
Centrifuge VWR 22628113 instrument for mammalian cell culture
Chemical fume hood N/A N/A instrument for carrying out IF reactions
Clear Cell Culture Plate 24 well flat-bottom w/ lid BD 353047 plate used for growing monoclonal cells
CytoOne T25 filter cap TC flask USA Scientific CC7682-4825 container for growing mammalian cells
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fischer Scientific BP231-100 reagent used for freezing down engineered mammalian cells
Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15-585-011 reagent for gel electrophoresis
Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Culture Microplate, with Lid Corning 353072 container for growing sorted monoclonal cells
FCS Express De Novo Software: N/A software for characterizing flow cytometry data
Fetal Bovine Serum, Regular, USDA 500 mL Corning 35-010-CV reagent for growing mammalian cells
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid – Raised ridge; 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 equipment for growing bacteria
Gibco DMEM, High Glucose Thermo Fisher Scientific 11-965-092 reagent for growing mammalian cells
Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL Life Technologies 10687-010 reagent for selecting cells with proper gene circuit integration
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad Laboratories 1708890 reagent for converting RNA to cDNA
Laboratory Freezer -20 °C VWR 76210-392 equipment for storing experimental reagents
Laboratory Freezer -80 °C Panasonic MDF-U74VC equipment for storing experimental reagents
Laboratory Refrigerator +4 °C VWR 76359-220 equipment for storing experimental reagents
LB Broth (Lennox) , 1 kg Sigma-Aldrich L3022-250G reagent for growing bacteria
LIPOFECTAMINE 3000 Life Technologies L3000008 reagemt for transfecting gene circuits into mammalian cells
MATLAB 2019 MathWorks N/A software for analyzing experimental data
Methanol Acros Organics 413775000 reagent for immunofluorescence reaction
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene 1.7 mL VWR 20170-333 plasticware container
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay Life Technologies 4331182 qPCR Probe
MultiTherm Shaker Benchmark Scientific H5000-HC equipment for bacterial transformation
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-NDL-US-CAN equipment for DNA/RNA concentration measurement
NEB Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2x Master Mix NEB M0492S reagent for PCR of gene circuit fragments
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs (NEB) C3019H bacterial cells for amplifying gene circuit of interest
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs (NEB) E2621L reagent for combining gene circuit fragements
Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope with a DS-Qi2 camera Nikon Instruments Inc. N/A instrument for quantifying gene expression
NIS-Elements Nikon Instruments Inc. N/A software for characterizing fluorescence microscopy data
oligonucleotides IDT N/A reagent used for PCR of gene circuit components
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA cellIQ Series CO2 Incubator with UV and H2O2 Control Panasonic MCO-170AICUVHL-PA instrument for growing mammalian cells
Paraformaldehyde, 16% Electron Microscopy Grade Electron Microscopy Sciences 15710-S reagent
PBS, Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1x) Invitrogen 14190144 reagent for mammalian cell culture,reagent for IF incubation buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100x Fisher Scientific 15140-122 reagent for growing mammalian cells
primary ERK antibody Cell Signaling Technology 4370S primary ERK antibody for immunifluorescence
primary KRAS antibody Sigma-Aldrich WH0003845M1 primary KRAS antibody for immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen 27106 reagent kit for purifying gene circuit plasmids
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 reagent kit for purifying gene circuit fragments
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Eppendorf A28137 equipment for qRT-PCR
Relative Quantification App Thermo Fisher Scientific N/A software for quantifying RNA/cDNA amplificaiton
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 kit for extracting RNA of engineered mammalian cells
Secondary ERK antibody Cell Signaling Technology 8889S secondary ERK antibody for immunifluorescence
secondary KRAS antibody Invitrogen A11005 secondary KRAS antibody for immunifluorescence
Serological Pipets 5.0 mL Olympus Plastics 12-102 reagents used for setting up a variety of chemical reactions
SmartView Pro Imager System Major Science UVCI-1200 tool for imaging correct PCR bands
SnapGene Viewer (free) or SnapGene SnapGene N/A software DNA sequence design and analysis
Stage top incubator Tokai Hit INU-TIZ tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444557 reagent for PCR of gene circuit fragments
TaqMan Human GAPD (GAPDH) Endogenous Control (VIC/MGB probe), primer limited, 2500 rxn Life Technologies 4326317E qPCR Probe
Thermocycler Bio-Rad 1851148 tool for carrying PCR, transformation, or gel extraction reactions
VisiPlate-24 Black, Black 24-well Microplate with Clear Bottom, Sterile and Tissue Culture Treated PerkinElmer 1450-605 plate used for light-induction experiments
VWR Disposable Pasteur Pipets, Glass, Borosilicate Glass Pipet, Short Tip, Capacity=2 mL, Overall Length=14.6 cm VWR 14673-010 reagent for mammalian cell culture
VWR Mini Horizontal Electrophoresis Systems, Mini10 Gel System VWR 89032-290 equipment for DNA gel electrophoresis
Flp-In 293 Thermo Fisher Scientific R75007 Engineered cell line with FRT site
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References

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Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (173), e62109, doi:10.3791/62109 (2021).
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