Visualisera och kvantifiera endonukleasbaserade platsspecifika DNA-skador
Summary
Denna artikel introducerar väsentliga steg av immunostaining och kromatin immunoprecipitation. Dessa protokoll används ofta för att studera DNA-skaderelaterade cellulära processer och för att visualisera och kvantifiera rekryteringen av proteiner som är inblandade i DNA-reparation.
Abstract
Celler utsätts kontinuerligt för olika DNA-skadliga medel, vilket inducera olika cellulära svar. Att tillämpa biokemiska och genetiska metoder är avgörande för att avslöja cellulära händelser i samband med rekrytering och montering av DNA-reparationskomplex på platsen för DNA-skador. Under de senaste åren har flera kraftfulla verktyg utvecklats för att inducera platsspecifika DNA-skador. Dessutom tillåter nya seminaltekniker oss att studera dessa processer på encellsupplösningsnivå med hjälp av både fasta och levande celler. Även om dessa tekniker har använts för att studera olika biologiska processer, presenterar vi häri de mest använda protokollen inom DNA-reparation, Fluorescens Immunostaining (IF) och Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), som i kombination med endonukleasbaserad platsspecifik DNA-skada gör det möjligt att visualisera och kvantifiera den genomiska beläggningen av DNA-reparationsfaktorer på ett riktat och reglerat sätt, respektive. Dessa tekniker ger kraftfulla verktyg för forskarna att identifiera nya proteiner som är bundna till den skadade genomiska locus samt deras post-translationella modifieringar som är nödvändiga för deras finjusterade reglering under DNA-reparation.
Introduction
Vårt genom utmanas ständigt av olika DNA-skadliga medel. Dessa angrepp kan härröra från miljökällor, såsom UV-ljus eller bestrålning, liksom från endogena källor, såsom metaboliska biprodukter orsakade av oxidativ stress eller replikeringsfel1,2. Dessa skador kan påverka integriteten hos antingen en eller båda DNA-strängarna, och om de genererade felen blir ihållande leder det ofta till flyttningar och genominstabilitet, vilket kan resultera i tumorigenesis3,4. För att upprätthålla genomintegriteten har flera reparationssystem utvecklats under evolutionen. Enligt de kemiska och fysiska egenskaperna hos specifika typer av DNA-skador kan flera reparationsmekanismer aktiveras. Missmatchningar, abasiska platser, ensträngsbrytningar och 8-oxoguanin (8-oxoG) kan tas bort antingen genom reparation av felmatchning eller reparationsväg5,6. Lesioner orsakade av UV-inducerade fotoprodukter och skrymmande adducts kan repareras antingen genom nukleotid-excision reparation (NER) eller DNA dubbelsträngsbrott reparation (DSBR) process7,8. NER består av två huvudsakliga undervägar: transkriptionskoppling NER (TC-NER) och global genomisk NER (GG-NER). När det gäller cellcykelfasen, efter DNA dubbelsträngad induktion, kan två undervägar aktiveras: icke-homolog end joining (NHEJ) och homolog rekombination (HR)1,9. NHEJ, som är den dominerande vägen i vilande celler, kan aktiveras i alla cellcykelfaser, vilket representerar en snabbare men felbenägen väg10. Å andra sidan är HR en felfri väg, där DSB repareras baserat på sekvens-homologisökning av systerkromatiderna, därför är den huvudsakligen närvarande i S- och G2-cellcykelfaser11. Dessutom är mikrohomologimedierad slutfogning (MMEJ) en annan DSB-reparationsmekanism, skild från de ovan nämnda, baserad på ett KU70/80- och RAD51-oberoende sätt att omdi ligatera tidigare resected mikrohomologous sekvenser flankerar de trasiga DNA-ändarna. Därför anses MMEJ vara felbenäget och mycket mutagena12. Under DNA-reparation kan DSB inducera DNA-skaderespons (DDR), vilket resulterar i aktivering av kontrollpunktskinaser som stoppar cellcykeln under reparation13,14,15. DDR aktiveras som ett svar på rekryteringen och omfattande spridning av initiativtagare nyckelspelare i reparationsprocessen runt skadorna, vilket bidrar till bildandet av ett reparationsfokus. I denna tidiga signal kaskad spelar ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) kinas en central roll genom att katalysera fosforylering av histonvarianten H2AX vid Ser139 (kallad γH2AX) runt lesion16. Denna tidiga händelse är ansvarig för rekryteringen av ytterligare reparationsfaktorer och inledandet av reparationsprocesser nedströms. Även om den exakta funktionen hos de rekryterade proteinerna vid reparationsfokus ännu inte har karakteriserats fullt ut, har bildandet och dynamiken i reparationsfoci undersökts av flera laboratorier. Dessa markörer används i stor utsträckning för att följa reparationskinetiken, men deras exakta roll under reparationsprocessen är fortfarande svårfångad. På grund av den stora betydelsen men ändå dålig förståelse för DNA-reparationsrelaterade cellulära processer har flera metoder utvecklats hittills för att inducera och visualisera DDR.
Olika metoder och system har fastställts för att inducera önskad typ av DNA-skador. Till exempel vissa medel [såsom neocarzinostatin (NCS), phleomycin, bleomycin, γ-bestrålning, UV] kan inducera ett stort antal slumpmässiga DNA-brott vid icke-prediktiva genomiska positioner, medan andra (endonukleaser, såsom AsiSI, I-PpoI eller I-SceI, liksom laserborttagning) kan inducera DNA-brott vid känd genomisk lokus17,18,19,20,21. Här fokuserar vi på de endonukleasebaserade tekniker som för närvarande används för att studera DDR i däggdjurs- och jästceller. Förutom att lyfta fram principerna för dessa tekniker betonar vi både deras fördelar och nackdelar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om DNA-reparation är ett relativt nytt forskningsområde expanderar vår kunskap snabbt med hjälp av olika biokemiska och mikroskopiska metoder. Att bevara genetisk information är avgörande för celler eftersom mutationer som förekommer i gener som är involverade i reparationsprocesser är bland de främsta orsakerna till tumorigenesis och därför är det viktigt att klargöra de viktigaste stegen i DNA-reparationsvägar.
Biokemiska tekniker (dvs. western blot, immunoprecipitation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av National Research, Development and Innovation Office grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, János Bolyai Research Scholarship of the Hungarian Academy of Sciences BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO short-term fellowship 8513 och Tempus Foundation.
Materials
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
References
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
- Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
- Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
- Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
- Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the ‘end’, it’s a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
- Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
- Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. 암 연구학. , (2020).
- Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
- Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
- Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
- Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
- Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
- Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
- Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
- Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
- Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
- Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
- Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein–DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).
