이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.
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방법 논문
엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포는 다양한 DNA 손상 제에 지속적으로 노출되어 다른 세포 반응을 유도합니다. 생화학적 및 유전적 접근을 적용하는 것은 DNA 손상의 사이트에 있는 DNA 복구 단지의 모집 그리고 조립과 관련되었던 세포 사건을 드러내는 데 필수적입니다. 지난 몇 년 동안, 몇 가지 강력한 도구는 사이트 특정 DNA 손상을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. 더욱이, 새로운 정액 기술은 우리가 고정및 살아있는 세포를 둘 다 사용하여 단세포 분해능 수준에서 이 프로세스를 공부할 수 있게 합니다. 이러한 기술은 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었지만, 본원에서 우리는 DNA 수리 분야에서 가장 널리 사용되는 프로토콜을 제시, 형광 면역 스테인링 (IF) 및 크로마티닌 면역 침전 (ChIP), 이는 엔토뇌 기반 사이트 별 DNA 손상과 함께 DNA 의 유전 적 점유 및 DNA 의 결합을 시각화하고 정량화 할 수 있도록 DNA 수리 요소의 유전 적 점유율을 정량화 할 수 있도록 각각. 이 기술은 DNA 수리 도중 그들의 미세 조정 규칙에 필요한 그들의 번역 후 수정뿐만 아니라 손상된 게놈 궤적에 묶인 새로운 단백질을 확인하기 위하여 연구원을 위한 강력한 공구를 제공합니다.
서론
우리의 게놈은 다양한 DNA 손상 에이전트에 의해 끊임없이 도전되고 있습니다. 이러한 공격은 자외선 이나 조사와 같은 환경 공급원뿐만 아니라 산화 스트레스 또는 복제 오류1,2로인한 대사 부산물과 같은 내인성 소스에서 유래할 수 있다. 이러한 병변은 하나 또는 두 DNA 가닥의 무결성에 영향을 미칠 수 있으며, 생성된 오류가 지속되면 자주 전좌 및 게놈 불안정으로 이어지며 종양 발생3,4가발생할 수 있습니다. 게놈 무결성을 유지하기 위해 진화 중에 여러 수리 시스템이 개발되었습니다. DNA 손상의 특정 유형의 화학 적 및 물리적 특성에 따르면, 여러 복구 메커니즘을 활성화 할 수있다. 불일치, 기본 부위, 단일 가닥 휴식 및 8-oxoguanine(8-oxoG)은 불일치 수리 또는 기본 절제 수리 경로5,6에의해 제거될 수 있다. UV 유도 광제품에 의한 병변 및 부피가 큰 부피가 큰 유도체는 뉴클레오티드 절제 수리(NER) 또는 DNA 이중 가닥 파손 수리(DSBR) 공정
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프로토콜
1. 특정 단백질의 면역 검출
- 세포 배양 및 실험 설정 준비
- 10% 태아 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 1% 항생제 항마이코틱 용액으로 보충된 DMEM 배양 배지의 단층층에서 U2OS 세포를 유지한다.
참고: 엔도누클로스 기반 DNA 손상 유도의 경우, 시스템 누출을 방지하기 위해 숯 처리 또는 스테로이드가 없는 매체를 사용하십시오. - 가습된 5%CO2 환경에서 37°C에서 80%의 수렴까지 세포를 성장시키고, 매 2-3일마다 배지를 갱신한다.
- 배지를 흡인하고 1x PBS로 셀을 세척합니다. 트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면, 세포에 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하여 세포 현탁액을 산출한다.
- 셀 카운팅 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다. 플레이트 2 x 104 셀/mL/웰 24웰 플레이트에 멸균 12mm 원형 커버립을 양호한 플레이트.
- 가습 5%CO2 분위기에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양하여 커버립에 부착할 수 있도록 한다.
- 손상된 에이전트를 배양 된 배지로 직접 파이프하여 네오카르지노스타틴 (NCS)의 10 ng /m....
- 10% 태아 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 1% 항생제 항마이코틱 용액으로 보충된 DMEM 배양 배지의 단층층에서 U2OS 세포를 유지한다.
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결과
세포에서 사이트 지향 DSB 유도 수리 프로세스를 연구하는 것은 안정적이거나 일시적인 과도 성 전도를 통해 달성 될 수있다. 그러나, 안정적인 형질전환이 균일하고 안정적인 세포 집단을 보장한다는 점에 유의해야 하며, 이는 통일되고 따라서 더 신뢰할 수 있는 세포 반응을 제공합니다. 일시적인 과도의 경우, 세포 인구의 극히 비율만이 실험에 다양성을 도입하는 플라스미드를 차지하고 유지합니다. ER-I-PpoI 또는 ER-AsiSI 엔도누셀 기반 세포 시스템을 확립하려면 50% 컨실릭 세포 집단이 필요하며, 이는 엔도나클로리스를 코딩하는 플라스미드로 보다 효과적으로 연관됩니다. 형질 전환의 경우, 시판되는 트랜스페트 시약 또는 바이러스 감염 기반 방법도 사용될 수 있다. 현미경 시각화 기술이 적용되고 과도 성 과도 형질이 필요한 경우, 지시된 DSB는 ER-융합 엔도넬리스에 결합하고 핵 전좌 및 DSB 유도를 허용하는 트랜스퍼션 후 24h4H에 의해 유도될 수 있다. 가장 적합한 시간 점을 결정하기 위해 4-OHT 처리 에 이어 다른.......
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토론
DNA 수리는 비교적 최근의 연구 분야이지만, 우리의 지식은 다양한 생화학 적 및 현미경 방법의 도움으로 급속하게 확장되고 있습니다. 유전 정보를 보존하는 것은 복구 프로세스에 관련되나는 유전자에서 생기는 돌연변이가 종양 발생의 주요 원인 중 하나이기 때문에 세포에 중요하고 그러므로 DNA 복구 통로의 중요한 단계를 해명하는 것은 필수적입니다.
생화학 적 기술 (즉, 서양 얼룩, 면역 침전, 질량 분석 등)은 많은 수의 세포를 필요로하며 연구 된 수리 과정은 원하는 세포 집단의 스냅 샷을 나타냅니다. ChIP 실험을 수행하는 것은 가공, 번거롭고 DSB 수리 과정을 연구하기 위해 특정 실험을 설계할 때 고려해야 합니다. 다음 단계는 몇 가지 예입니다: (I) 세포는 제대로 lysed해야; 크로마티틴 분획(II) 크로마틴에 대한 접근성이 높을 수 있도록 별도의 세포 및 핵 용해 버퍼를 사용하여 2단계 용해 방법을 적용하는 것이 매우 좋습니다. 초음파 처리의 적절한 조건은 사전에 각.......
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감사의 글
이 연구는 국가 연구 개발 및 혁신 사무소 보조금 GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, 헝가리 과학 BO/27/20의 자노스 볼라이 연구 장학금, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO 단기 펠로우십 8513, 템퍼스 재단 8513.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4-OHT | 시그마 Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| 항생제-항진균 용액(100×), 안정화 | 시그마 Aldrich | A5955 | |
| 항감마 H2A. X (phospho S139) 항체 | Abcam | ab26350 | |
| 소 혈청 분획 V 알부민 | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ 시안/노란색 로딩 버퍼 | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| Dem, 1.0 g/L 포도당, L-글루타민 없음 | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 양 안티-마우스 IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 양 안티 토끼 IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | 시그마 Aldrich | E6758 | |
| EGTA | 시그마 Aldrich | E3889 | |
| 에탄올 | 어금니 화학 물질 | 02910-101-340 | |
| 소 태아 혈청(남미 원산지), EU 승인 | Gibco | ECS0180L | |
| 포름알데히드 37% 용액 무산 | 시그마 알드리치 | 1.03999 | |
| 글루타맥스&트레이드; 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| 글리신 | 시그마 알드리치 | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| 이소 아밀 알코올 | 시그마 알드리 | W205702 | |
| LiCl | 시그마 알드리치 | L9650 | |
| NaCl | 시그마 알드리치 | S5886 | |
| Na-DOC | 시그마 알드리치 | D6750 | |
| NaHCO3 | 시그마 알드리치 | S5761 | |
| 스트렙토마이세스 카지노스테틱스의 네오카르지노스타틴 | 시그마 알드리치 | N9162 | |
| NP-40 | 시그마 알드리치 | I8896 | |
| Ca2+, Mg2+가 없는 PBS 분말 | 드리치 | L182-50-BC | |
| 페놀 | 시그마 알드리치 | P4557 | |
| 파이프 | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | 몰 화학물질 | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ DAPI Thermo | Fisher Scientific | P36935 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 세트 I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs 항체 | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | 시그마 알드리치 | S2889 | |
| SDS | 시그마 알드리치 | L3771 | |
| 트리스 아세테이트-EDTA 버퍼 | 시그마 알드리치 | T6025 | |
| 트리스-HCl | 시그마 알드리치 | 91228 | |
| TRITON X-100 | 어금니 화학 물질 | 09370-006-340 | |
| 돼지 췌장에서 추출한 트립신 | 시그마 알드리치 | T4799 | |
| 트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드 | Gibco | 15400054 |
참고문헌
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
- Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....
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