الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح
Summary
هنا نقدم بروتوكولا لتكييف طريقة وضوح أنسجة الدماغ لشبكية العين كاملة جبل لتحسين نوعية تلطيخ المناعية القياسية والتصوير عالي الدقة من الخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية.
Abstract
تم تعديل طريقة التهذير الهيدروجيل الأنسجة (CLARITY)، التي وضعت أصلا من قبل مختبر Deisseroth، وتستخدم على نطاق واسع لاحتواء المناعة والتصوير لعينات الدماغ سميكة. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه التكنولوجيا المتقدمة بعد لشبكية العين كاملة التركيب. على الرغم من أن شبكية العين شفافة جزئيا، إلا أن سمكها البالغ حوالي 200 ميكرومتر (في الفئران) لا يزال يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة وكذلك الحد من اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة. هنا، قمنا بتكييف طريقة CLARITY لشبكية العين الماوس جبل كامل عن طريق البلمرة لهم مع مونومر الأكريلاميد لتشكيل هيدروجيل نانوبري ومن ثم تطهيرها في كبريتات دودسيل الصوديوم للحد من فقدان البروتين وتجنب تلف الأنسجة. كانت شبكية العين المجهزة بالوضوح ملطخة بالمناعة بأجسام مضادة للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية والبروتينات المتشابكة ، مثبتة في محلول مطابق لمؤشر الانكسار ، وصورت. تظهر بياناتنا أن CLARITY يمكن أن يحسن جودة تلطيخ المناعة الكيميائية القياسية والتصوير للخلايا العصبية الشبكية والخلايا الدبقية في إعداد التركيب الكامل. على سبيل المثال ، تم تحسين الدقة ثلاثية الأبعاد للهياكل الدقيقة الشبيهة بالفأس والتشجرات لخلايا amacrine الدوبامين بشكل كبير من خلال CLARITY. بالمقارنة مع شبكية العين غير المصنعة كاملة التركيب ، يمكن أن يكشف CLARITY عن وجود مناعة للبروتينات المتشابكة مثل بروتين الكثافة بعد المتشابك 95. تظهر نتائجنا أن CLARITY يجعل شبكية العين أكثر شفافية بصريا بعد إزالة الدهون ويحافظ على الهياكل الدقيقة للخلايا العصبية الشبكية وبروتيناتها ، والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني للحصول على تصوير عالي الدقة للخلايا العصبية الشبكية وهياكلها دون الخلوية في إعداد التركيب الكامل.
Introduction
قد تكون الشبكية الفقارية هي الجزء الأكثر سهولة في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وهي بمثابة نموذج ممتاز لدراسة تطور الدماغ وبنيته ووظيفته. يتم توزيع خمس فئات من الخلايا العصبية في شبكية العين في ثلاث طبقات نووية مفصولة طبقتين شكلية. تتكون الطبقة النووية الخارجية (ONL) من مستقبلات ضوئية كلاسيكية (قضبان ومخاريط) تحول الضوء إلى إشارات كهربائية. تتم معالجة الإشارات الكهربائية بواسطة الخلايا العصبية في الطبقة النووية الداخلية (INL)، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب والأفقية والأماكرين، ثم تنتقل إلى خلايا العقدة الشبكية (RGCs) في طبقة خلايا العقدة (GCL). RGCs هي الخلايا العصبية الناتجة من شبكية العين، مع محاور عصبية إسقاط إلى الدماغ للمساهمة في تشكيل الصورة وغير تشكيل الصورة وظيفة بصرية. بالإضافة إلى ذلك، توفر ثلاثة أنواع من الخلايا الدبقية (خلايا مولر، والأستروغليا، والميكروجليا) العناصر الغذائية للخلايا العصبية وتحمي الخلايا العصبية من التغيرات الضارة في بيئتها خارج الخلية.
واحد السكان الفرعية المتخصصة من خلايا الاماكرين تنتج وتطلق الدوبامين, neuromodulator هامة في الجهاز العصبي المركزي, إعادة تكوين الدوائر العصبية الشبكية خلال التكيف مع الضوء1,2. خلايا الدوبامين amacrine (DACs) لديها ميزة فريدة من ملامح مورفولوجية. وتقع سوماتا بهم في INL القريبة مع dendrites ramifying في الجزء الأكثر قاصرة من طبقة plexiform الداخلية (IPL). عمليات تشبه أكسون من DACs هي unmyelinated، رقيقة وطويلة، متفرعة بشكل متفرق، وتحمل الدوالي (مواقع إطلاق الدوبامين). أنها تشكل الضفيرة الكثيفة مع dendrites في IPL، بما في ذلك هياكل تشبه حلقة حول سوماتا من خلايا AII amacrine. المحاور أيضا تشغيل من خلال INL نحو OPL, تشكيل مسار الطرد المركزي عبر شبكية العين3. لقد أثبتنا أن عمليات DAC تعبر عن المستقبلات استجابة لإطلاق الغلوتامات من الخلايا العصبية presynaptic، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب وخلايا العقدة الشبكية الحساسة للضوء في جوهرها (ipRGCs)4،5،6. ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كانت مستقبلات الغلوتامات تعبر عن محاور الفأس، التشعبات، أو كليهما لأنها مقطوعة في أقسام الشبكية الرأسية ولا يمكن تمييزها عن بعضها البعض5،6. يجب إجراء التلطخ المناعي في شبكية العين الكاملة للكشف عن تفريع ثلاثي الأبعاد ل DACs ووجود مستقبلات الغلوتامات على المقصورات دون الخلوية. على الرغم من أن شبكية العين شفافة نسبيا، إلا أن سمك شبكية العين ذات التركيب الكامل للفأر يبلغ حوالي 200 ميكرومتر، مما يحد من اختراق الأجسام المضادة للأنسجة العميقة، فضلا عن تقليل اختراق الضوء للتصوير عالي الدقة بسبب تشتت الأنسجة الخفيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتكييف طريقة التهذييل الهيدروجيل الأنسجة المتوافقة (CLARITY) التي تم تطويرها مؤخرا لأقسام الدماغ السميكة إلى شبكية العين الماوس جبل كامل7.
تم تطوير طريقة CLARITY في الأصل من قبل مختبر Deisseroth لاحتواء المناعة وتصوير عينات الدماغ السميكة7. ويستخدم المنظفات القوية، كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) والكهربائية لإزالة مكونات الدهون (التي تسبب تشتت الضوء الأنسجة)، وترك البروتينات والأحماض النووية في مكانها. يتم استبدال الدهون إزالتها مع سقالة شفافة تتكون من مونومرات هيدروجيل مثل الأكريلاميد لدعم بنية البروتين المتبقية. يمكن تسمية الأنسجة المطهية عن طريق الكيمياء المناعية وصورت مع زيادة كبيرة في عمق اختراق الضوء من خلال الأنسجة (تصل إلى عدة ملليمترات تحت سطح الأنسجة). ومنذ ذلك الحين، تم تحسين طريقة CLARITY وتبسيطها من قبل العديد من مجموعات البحث8و9و10. يستخدم بروتوكول CLARITY المعدل تقنية إزالة سلبية لتجنب تلف الأنسجة المحتمل الناتج عن الكهتروفورسيس لتطهير الدماغ كله والأعضاء الأخرى السليمة11. ومع ذلك، لم يتم تطبيق هذه الطريقة بعد على شبكية العين كاملة التركيب. هنا، قمنا بتكييف تقنية CLARITY السلبية لشبكية العين الكاملة لجعلها أكثر شفافية للكيمياء المناعية والتصوير. وجدنا أن غالبية بروتينات الشبكية التي تم اختبارها تم الحفاظ عليها خلال هذه العملية للكيمياء المناعية. باستخدام معامل الانكسار مطابقة الحل، كنا قادرين على صورة الخلايا العصبية الشبكية عبر سمك ما يقرب من 200 ميكرومتر من ONL إلى GCL في شبكية العين جبل كامل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعديل بروتوكول CLARITY لشبكية العين كاملة التركيب.
لقد قمنا بتبسيط بروتوكول CLARITY لتحقيق البلمرة الكافية دون الحاجة إلى إخلاء فراغ أو غرفة الجفاف ، كما هو مستخدم في معظم الدراسات السابقة7و9و11. يتم تثبيط عملية البلمرة عن طريق الأكسج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر بينغ يي، وناثان سبيكس، وهاو ليو على الدعم التقني. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للمنح الصحية EY022640 (D.-Q.Z.) وجائزة أبحاث الطلاب الجامعيين في جامعة أوكلاند (E.J.A.).
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
