Иммуноокрашивание цельно-маунтных сетчаток с помощью метода очистки тканей CLARITY
Summary
Здесь мы представляем протокол адаптации метода CLARITY тканей мозга для цельномонтных сетчаток для улучшения качества стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации с высоким разрешением нейронов сетчатки и их субклеточных структур.
Abstract
Метод делипидации тканевого гидрогеля (CLARITY), первоначально разработанный лабораторией Дейссерота, был модифицирован и широко используется для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга. Однако эта передовая технология еще не использовалась для цельномонтных сетчаток. Хотя сетчатка частично прозрачна, ее толщина примерно 200 мкм (у мышей) по-прежнему ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением. Здесь мы адаптировали метод CLARITY для цельномонтовых сетчаток мышей, полимеризовав их акриламидным мономером с образованием нанопористого гидрогеля, а затем очистив их в додецилсульфате натрия, чтобы свести к минимуму потерю белка и избежать повреждения тканей. Обработанные CLARITY сетчатки были иммуноокражены антителами к нейронам сетчатки, глиальным клеткам и синаптическим белкам, установлены в растворе, соответствующем индексу преломления, и визуалированы. Наши данные показывают, что CLARITY может улучшить качество стандартного иммуногистохимического окрашивания и визуализации нейронов сетчатки и глиальных клеток при подготовке к целому по креплению. Например, 3D-разрешение тонких аксоноподобных и дендритных структур дофаминергических амакриновых клеток было значительно улучшено CLARITY. По сравнению с необработанными цельномонтными сетчатками, CLARITY может выявить иммуноокрашивание синаптических белков, таких как белок постсинаптической плотности 95. Наши результаты показывают, что CLARITY делает сетчатку более оптически прозрачной после удаления липидов и сохраняет тонкие структуры нейронов сетчатки и их белков, которые могут обычно использоваться для получения визуализации нейронов сетчатки и их субклеточных структур с высоким разрешением при подготовке к целому монтажу.
Introduction
Сетчатка позвоночных является, пожалуй, наиболее доступной частью центральной нервной системы (ЦНС), и она служит отличной моделью для изучения развития, структуры и функции мозга. Пять классов нейронов в сетчатке распределены в трех ядерных слоях, разделенных двумя плексиформными слоями. Внешний ядерный слой (ONL) состоит из классических фоторецепторов (стержней и колбочка), которые преобразуют свет в электрические сигналы. Электрические сигналы обрабатываются нейронами во внутреннем ядерном слое (INL), включая биполярные, горизонтальные и амакриновые клетки, а затем передаются в ганглиоцитные клетки сетчатки (RGCs) в ганглиевом клеточном слое (GCL). RGC являются выходными нейронами сетчатки, при этом аксоны проецируются на мозг, чтобы способствовать формированию изображения и не-образующей визуальные функции. Кроме того, три типа глиальных клеток (клетки Мюллера, астроглия и микроглия) обеспечивают нейроны питательными веществами и защищают нейроны от вредных изменений в их внеклеточной среде.
Одна специализированная субпопуляция амакриновых клеток продуцирует и высвобождает дофамин, важный нейромодулятор в ЦНС, реконфигурируемый нейронные цепи сетчатки во время световой адаптации1,2. Дофаминергические амакриновые клетки (ЦАП) обладают уникальной особенностью морфологических профилей. Их соматы расположены в проксимальном INL с дендритами, разветвляющимися в самой дистальной части внутреннего плексиформного слоя (IPL). Аксоноподобные процессы ЦАП немиелиновые, тонкие и длинные, редко разветвленные и несут варикозное расширение вен (места высвобождения дофамина). Они образуют плотное сплетение с дендритами в IPL, включая кольцеподобные структуры вокруг соматов амакриновых клеток AII. Аксоны также проходят через INL к OPL, образуя центробежный путь через сетчатку3. Мы продемонстрировали, что процессы DAC экспрессируют рецепторы в ответ на высвобождение глутамата из пресинаптических нейронов, включая биполярные клетки и внутренне светочувствительные ганглиозные клетки сетчатки (ipRGCs)4,5,6. Однако неясно, экспрессируются ли глутаматные рецепторы на аксонах, дендритах или на обоих, поскольку они отрезаны в вертикальных срезах сетчатки и не могут быть отличимы друг от друга5,6. Иммуноокрашивание необходимо проводить в цельномонтных сетчатках, чтобы выявить трехмерное разветвление ЦАП и наличие глутаматных рецепторов на субклеточных компартментах. Хотя сетчатка относительно прозрачна, толщина сетчатки с целым креплением мыши составляет примерно 200 мкм, что ограничивает проникновение антител в глубокие ткани, а также уменьшает проникновение света для визуализации с высоким разрешением из-за рассеяния света в тканях. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы адаптировали иммуноокрашающий совместимый метод делипидации тканевых гидрогелей (CLARITY), разработанный недавно для толстых участков мозга, к цельной сетчатке мыши7.
Метод CLARITY был первоначально разработан лабораторией Дейссерота для иммуноокрашения и визуализации толстых образцов мозга7. Он использует сильное моющее средство, додецилсульфат натрия (SDS) и электрофорез для удаления липидных компонентов (которые вызывают рассеяние света в тканях), оставляя белки и нуклеиновые кислоты на месте. Удаленные липиды заменяются прозрачным каркасом, состоящим из гидрогелевых мономеров, таких как акриламид, для поддержки оставшейся белковой структуры. Очищенная ткань может быть помечена с помощью иммуногистохимии и визуалирована с существенно увеличенной глубиной проникновения света через ткань (до нескольких миллиметров ниже поверхности ткани). С тех пор метод CLARITY был оптимизирован и упрощен несколькими исследовательскими группами8,9,10. Модифицированный протокол CLARITY использует пассивную технику очистки, чтобы избежать возможного повреждения тканей, вызванного электрофорезом для очистки всего мозга и других неповрежденных органов11. Однако этот метод еще не применялся к цельномонтным сетчаткам. Здесь мы адаптировали пассивную технику CLARITY для цельномонтных сетчаток, чтобы сделать их более прозрачными для иммуногистохимии и визуализации. Мы обнаружили, что большинство протестированных белков сетчатки были сохранены во время этого процесса иммуногистохимии. Используя решение для сопоставления показателей преломления, мы смогли получить изображение нейронов сетчатки толщиной около 200 мкм от ONL до GCL в цельных сетчатках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модификация протокола CLARITY для цельномонтных сетчаток.
Мы упростили протокол CLARITY для достижения адекватной полимеризации без необходимости вакуумной вакуумной эвакуации или сухой камеры, как это используется в большинстве предыдущих исследований7,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Бин Е, Натана Спикса и Хао Лю за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Национальным институтом грантов здравоохранения EY022640 (D.-Q.Z.) и Оклендского университета Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
