CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon
Summary
Burada, standart immünohistokimyasal lekelenme ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme kalitesini artırmak için beyin dokularının CLARITY yöntemini tam montajlı retinalara uyarlamak için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Başlangıçta Deisseroth laboratuvarı tarafından geliştirilen doku hidrojel delipidasyon yöntemi (CLARITY), kalın beyin örneklerinin immünostainasyonu ve görüntülenmesi için değiştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bu ileri teknoloji henüz tam montajlı retinalar için kullanılmamıştır. Retina kısmen şeffaf olmasına rağmen, yaklaşık 200 μm kalınlığı (farelerde) hala antikorların derin dokuya nüfuzunu sınırlar ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyonunu azaltır. Burada, protein kaybını en aza indirmek ve doku hasarını önlemek için akrilamid monomer ile polimerleştirerek nanoporöz bir hidrojel oluşturmak ve daha sonra sodyum dodecyl sülfatta temizlemek için tüm mount fare retinaları için CLARITY yöntemini uyarladık. CLARITY ile işlenmiş retinalar, retina nöronları, glial hücreler ve sinaptik proteinler için antikorlarla immünostain edildi, kırılma indeksi eşleştirme çözeltisine monte edildi ve görüntülendi. Verilerimiz CLARITY’nin retina nöronları ve glial hücreler için standart immünohistokimyasal boyama ve görüntüleme kalitesini tam montajlı hazırlıkta artırabileceğini göstermektedir. Örneğin, dopaminerjik amakrin hücrelerin ince akson benzeri ve dendritik yapılarının 3D çözünürlüğü CLARITY tarafından çok daha iyi hale getirildi. İşlenmemiş tam montajlı retinalarla karşılaştırıldığında CLARITY, postinaptik yoğunluk proteini 95 gibi sinaptik proteinler için immünostaining ortaya çıkarabilir. Sonuçlarımız, CLARITY’nin lipitlerin çıkarılmasından sonra retinayı daha optik olarak şeffaf hale getirdiğini ve retina nöronlarının ve proteinlerinin ince yapılarını koruduğunu ve retina nöronlarının ve bunların hücre altı yapılarının tüm montajlı preparat içinde yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için rutin olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Omurgalı retina, merkezi sinir sisteminin (CNS) belki de en erişilebilir kısmıdır ve beynin gelişimini, yapısını ve işlevini incelemek için mükemmel bir model görevi görür. Retinadaki beş nöron sınıfı, iki pleksiform katmanla ayrılmış üç nükleer katmanda dağıtılır. Dış nükleer tabaka (ONL), ışığı elektrik sinyallerine dönüştüren klasik fotoreceptörlerden (çubuklar ve koniler) oluşur. Elektrik sinyalleri, bipolar, yatay ve amakrin hücreler de dahil olmak üzere iç nükleer tabakadaki (INL) nöronlar tarafından işlenir ve daha sonra ganglion hücre tabakasındaki (GCL) retinal ganglion hücrelerine (RGC’ ler) iletilir. RGC’ler retinanın çıkış nöronlarıdır, aksonlar görüntü oluşturan ve görüntü oluşturmayan görsel işleve katkıda bulunmak için beyne yansıtır. Ek olarak, üç tür glial hücre (Muller hücreleri, astroglia ve mikroglia) nöronlara besin sağlar ve nöronları hücre dışı ortamlarındaki zararlı değişikliklerden korur.
Amakrin hücrelerinin özel bir alt nüfus, CNS’de önemli bir nöromodülatör olan dopamin üretir ve serbest bırakır, ışık adaptasyonu sırasında retinal sinir devrelerini yeniden yapılandırır1,2. Dopaminerjik amakrin hücreler (DAC’ ler) morfolojik profillerin benzersiz bir özelliğine sahiptir. Somataları proksimal INL’de bulunur ve dendritler iç pleksiform tabakanın (IPL) en distal kısmında ortaya çıkar. DAC’lerin akson benzeri süreçleri boyasız, ince ve uzun, seyrek dallıdır ve varikoziteleri taşır (dopamin salınım bölgeleri). AII amacrine hücrelerinin somata etrafındaki halka benzeri yapılar da dahil olmak üzere IPL’de dendritleri olan yoğun bir pleksus oluştururlar. Aksonlar ayrıca INL’den OPL’ye doğru ilerler ve retina3boyunca santrifüj bir yol oluşturur. DAC süreçlerinin, bipolar hücreler ve özünde ışığa duyarlı retina ganglion hücreleri (ipRGC’ler)4,5,6dahil olmak üzere presynaptik nöronlardan glutamat salınımı yanıt olarak reseptörleri ifade ettiğini gösterdik. Bununla birlikte, glutamat reseptörlerinin aksonlar, dendritler veya her ikisi de dikey retina bölümlerinde kesildiğinden ve birbirinden ayırt edilemediğinden ifade edip etmediği belirsizdir5,6. DAC’lerin üç boyutlu dallanmalarını ve hücre altı bölmelerde glutamat reseptörlerinin varlığını ortaya çıkarmak için tüm montajlı retinalarda immünostaining yapılması gerekir. Retina nispeten şeffaf olmasına rağmen, bir farenin tam montajlı retina kalınlığı yaklaşık 200 μm’dir, bu da antikorların derin dokuya nüfuz etmesini sınırlar ve doku ışığı saçılım nedeniyle yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyonunu azaltır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son zamanlarda kalın beyin bölümleri için geliştirilen immünostaining uyumlu doku hidrojel delipidasyon yöntemini (CLARITY) tüm montajlı fare retinalarına uyarladık7.
CLARITY yöntemi başlangıçta Kalın beyin örneklerinin immünostaining ve görüntüleme için Deisseroth laboratuvarı tarafından geliştirilmiştir7. Lipid bileşenlerini (doku ışığının saçılmasına neden olan) çıkarmak için proteinleri ve nükleik asitleri yerinde bırakarak güçlü bir deterjan, sodyum dodecyl sülfat (SDS) ve elektroforezi kullanır. Çıkarılan lipitler, kalan protein yapısını desteklemek için akrilamid gibi hidrojel monomerlerden oluşan şeffaf bir iskele ile değiştirilir. Temizlenen doku immünhistokimya ile etiketlenebilir ve doku boyunca önemli ölçüde artan ışık penetrasyon derinliği ile görüntülenebilir (doku yüzeyinin birkaç milimetre altına kadar). O zamandan beri CLARITY yöntemi birkaç araştırma grubu8, 9,10tarafından optimize edilmiş ve basitleştirilmiştir. Değiştirilmiş bir CLARITY protokolü, tüm beyni ve diğer sağlam organları temizlemek için elektroforez tarafından üretilen olası doku hasarını önlemek için pasif bir temizleme tekniği kullanır11. Ancak bu yöntem henüz tam mount retinalara uygulanmamıştır. Burada, pasif CLARITY tekniğini tüm mount retinalar için immünhistokinoloji ve görüntüleme için daha şeffaf hale getirmek için uyarladık. İmmünohistokinoloji için test edilen retina proteinlerinin çoğunluğunun bu süreçte korunduğunu tespit ettik. Kırma indeksi eşleştirme solüsyonını kullanarak, retina nöronlarını ONL’den GCL’ye kadar yaklaşık 200 μm kalınlığında tüm montajlı retinalarda görüntüleyebildik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm montajlı retinalar için CLARITY protokolünün değiştirilmesi.
Daha önceki çalışmaların çoğunda kullanıldığı gibi vakum tahliyesi veya tahliye odasına ihtiyaç duymadan yeterli polimerizasyon elde etmek için CLARITY protokolünü basitleştirdik7,9,11. Polimerizasyon işlemi oksijen tarafından inhibe edilir ve protokolün polimerizasyon adımı sırasında numunenin havadan izole edilme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik destek için Bing Ye, Nathan Spix ve Hao Liu’ya teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeleri Enstitüsü EY022640 (D.-Q.Z.) ve Oakland Üniversitesi Provost Lisans Öğrenci Araştırma Ödülü (E.J.A.) tarafından desteklendi.
Materials
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Fixative |
| Acrylamide | Fisher Biotech | BP170 | Hydrogel monomer |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | Fluorscence microscope | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | Blocking agent |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | Scanning confocal microscope | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Buffer component |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Buffer component |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | Buffer component |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Buffer component |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Buffer component |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | Bacteriostatic preservative |
| NDS | Aurion | 900.122 | Blocking agent |
| NIS Elements AR | Nikon | Image analysis software | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Delipidation agent |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Buffer component |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Surfactant |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfactant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Thermal initiator |
References
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
