Estimación De Nanocristales Urinarios En Humanos Usando Etiquetado De Fluoróforo De Calcio Y Análisis De Seguimiento De Nanopartículas
Summary
El objetivo de este estudio fue determinar si el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) podría detectar y cuantificar el calcio urinario que contiene nanocristales de adultos sanos. Los hallazgos del estudio actual sugieren que NTA podría ser una herramienta potencial para estimar nanocristales urinarios durante la enfermedad por cálculos renales.
Abstract
Los cálculos renales son cada vez más frecuentes en todo el mundo en adultos y niños. El tipo más común de cálculos renales se compone de cristales de oxalato de calcio (CaOx). La cristaluria ocurre cuando la orina se sobresatura con minerales (por ejemplo, calcio, oxalato, fosfato) y precede a la formación de cálculos renales. Los métodos estándar para evaluar la cristaluria en formadores de piedra incluyen microscopía, filtración y centrifugación. Sin embargo, estos métodos detectan principalmente microcristales y no nanocristales. Se ha sugerido que los nanocristales son más dañinos para las células epiteliales renales que los microcristales in vitro. Aquí, se describe la capacidad del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para detectar nanocristales urinarios humanos. Alimentaron a los adultos sanos una dieta controlada del oxalato antes de beber una carga del oxalato para estimular nanocrystals urinarios. La orina fue recogida por 24 horas antes y después de la carga del oxalato. Las muestras fueron procesadas y lavadas con etanol para purificar las muestras. Los nanocrystals urinarios fueron manchados con el fluoróforo obligatorio del calcio, Fluo-4. Después de la coloración, el tamaño y la cuenta de nanocristales fueron determinados usando NTA. Los hallazgos de este estudio muestran que NTA puede detectar de manera eficiente la nanocristaluria en adultos sanos. Estos hallazgos sugieren que NTA podría ser un método temprano valioso de la detección de nanocrystalluria en pacientes con enfermedad de la piedra de riñón.
Introduction
Los cristales urinarios se forman cuando la orina se sobresatura con minerales. Esto puede ocurrir en individuos sanos pero es más común en individuos con cálculos renales1. La presencia y acumulación de cristales urinarios puede aumentar el riesgo de desarrollar un cálculo renal. Específicamente, esto ocurre cuando los cristales se unen a la placa de Randall, se nuclean, se acumulan y crecen con el tiempo2,3,4. La cristaluria precede a la formación de cálculos renales y la evaluación de la cristaluria puede tener valor predictivo en formadores de cálculos renales3,5. Específicamente, se ha sugerido que la cristaluria es útil para predecir el riesgo de recurrencia de la piedra en pacientes con antecedentes de oxalato de calcio que contiene piedras6,7.
Se ha informado que los cristales tienen un impacto negativo en la función de las células inmunes renales epiteliales y circulantes8,9,10,11, 12,13. Se ha relatado previamente que los monocitos circulantes de oxalato de calcio (CaOx) formadores de cálculos renales han suprimido la bioenergética celular en comparación con los individuos sanos14. Además, los cristales de CaOx reducen la bioenergética celular e interrumpen la homeostasis redox en los monocitos8. El consumo de comidas ricas en oxalato puede causar cristaluria que podría conducir a daño renal en el túbulo y alterar la producción y función de macromoléculas urinarias que protegen contra la formación de cálculos renales15,16. Varios estudios han demostrado que los cristales urinarios pueden variar en forma y tamaño dependiendo del pH y la temperatura de la orina17,18,19. Además, se ha demostrado que las proteínas urinarias modulan el comportamiento de los cristales20. Daudon et al.19,propusieron que el análisis de cristaluria podría ser útil en el manejo de pacientes con enfermedad por cálculos renales y en la evaluación de su respuesta a las terapias. Algunos métodos convencionales actualmente disponibles para evaluar la presencia de cristales incluyen microscopía polarizada21,22,microscopía electrónica23,contadores de partículas3,filtración de orina24,evaporación3,5 o centrifugación21. Estos estudios han proporcionado la penetración valiosa al campo de la piedra de riñón con respecto a crystalluria. Sin embargo, una limitación de estos métodos ha sido la incapacidad de visualizar y cuantificar cristales de menos de 1 μm de tamaño. Cristales de este tamaño pueden influir en el crecimiento de las piedras de CaOx mediante la fijación a la placa de Randall.
Se ha demostrado que los nanocristales causan una lesión extensa a las células renales en comparación con los microcristales más grandes25. La presencia de nanocristales se ha reportado en orina utilizando un analizador de nanopartículas26,27. Estudios recientes han utilizado sondas de bisfosfato marcados fluorescentemente (alendronato-fluoresceína/alendronato-Cy5) para examinar nanocristales utilizando citometría de flujo a nanoescala28. La limitación de este tinte es que no es específico y se unirá a casi todos los tipos de piedras excepto la cisteína. Por lo tanto, evaluar con precisión la presencia de nanocristales en individuos puede ser una herramienta eficaz para diagnosticar la cristaluria y/o predecir el riesgo de cálculos. El propósito de este estudio fue detectar y cuantificar nanocristales que contienen calcio (<1 μm de tamaño) utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Para lograr esto, se utilizó la tecnología NTA en combinación con un fluoróforo de unión al calcio, Fluo-4 AM, para detectar y cuantificar nanocristales que contienen calcio en la orina de adultos sanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
NTA se ha utilizado en el actual estudio para evaluar nanocrystals en orina humana usando una punta de prueba obligatoria del calcio, Fluo-4 AM. No hay un método estándar disponible para detectar nanocristales en la orina. Algunos grupos de investigación han detectado nanocristales en la orina y se han basado en el uso de extensos protocolos o métodos que son limitados en su capacidad para cuantificar las muestras27,28. Este estudio muestra un método especí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a todos los participantes del estudio y al Núcleo de Bionutrición CCTS de la UAB y al Centro de Servicio de Imágenes de Alta Resolución de la UAB por sus contribuciones. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH DK106284 y DK123542 (TM), y UL1TR003096 (Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales).
Materials
| Benchtop Centrifuge | Jouan Centrifuge | CR3-12 | |
| Calcium Oxalate monohydrate | Synthesized in the lab as previously described29. | Store at RT; Stock 10 mM | |
| Calcium Phosphate crystals (hydroxyapatite nanopowder) | Sigma | 677418 | Store at RT; Stock 10 mM |
| Ethanol | Fischer Scientific | AC615095000 | Store at RT; Stock 100% |
| Fluo-4 AM* | AAT Bioquest, Inc. | 20550 | Store at Freezer (-20°C); Stock 5 mM |
| Gold Nanoparticles | Sigma | 742031 | Store at 2-8°C |
| NanoSight Instrument | Malvern Instruments, UK | NS300 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 98-4730 | |
| Virkon Disinfectant | LanXESS Energizing Company, Germany | LSP | |
| *Fluorescence dyes are light sensitive; stock and aliquots should be stored in the dark at -20°C. | |||
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