プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造
Summary
このプロトコルは、プローブチップ超音波処理を使用して大量の脂質カプセル化デカフルオロブタンマイクロバブルを生成し、その後、高圧押出および機械的濾過を使用してフェーズシフトナノ液滴に凝縮する方法を記述する。
Abstract
画像処理および治療のための気化可能な位相シフト液滴の製造に使用できる多くの方法があります。各方法は、さまざまな技術を利用し、価格、材料、目的が異なります。これらの製造方法の多くは、不均一な活性化閾値を有する多分散集団をもたらす。さらに、液滴サイズを制御するには、通常、生体内で実用的ではない高い活性化閾値を有する安定したパーフルオロカーボン液体が必要です。低沸点ガスを用いて均一な液滴サイズを作製することは、インビボイメージングおよび治療実験に有益であろう。本稿では、低沸点デカフルオロブタン(DFB)を用いたサイズフィルター脂質安定化位相シフトナノ液滴の形成のための、簡便で経済的な方法について述べている。脂質マイクロバブルを生成する一般的な方法は、一回のステップで高圧押出でそれらを凝縮する新しい方法に加えて、記載されている。この方法は、多くの生物学的実験室で見られる一般的な実験装置を使用して、時間を節約し、効率を最大化し、マイクロバブルおよびナノドロップレットソリューションの大量を生成するように設計されています。
Introduction
超音波造影剤(UCA)は、画像および治療用途で急速に人気が高まっています。マイクロバブルは、元のUCAであり、現在臨床診断アプリケーションで使用される主流の薬剤です。マイクロバブルは、ガスで満たされた球体で、通常は直径1~10μmで、脂質、タンパク質、ポリマーシェル1で囲まれています。ただし、そのサイズと生体内での安定性は、多くのアプリケーションで機能を制限することができます。過熱した液体コアを含む位相シフトナノドロップレットは、サイズが小さく、循環寿命が改善されたため、これらの制限のいくつかを克服することができます。熱または音響エネルギーにさらされると、過熱した液体コアが気化して気体マイクロバブル2,3,4,5を形成します。気化閾値は液滴サイズ5,6に直接関係するため、一貫した活性化閾値を達成するために、一様なサイズの液滴懸濁液を処方することが非常に望ましいであろう。均一な液滴サイズを生成する配合方法は、しばしば複雑でコストがかかり、より費用対効果の高いアプローチは多分散溶液7をもたらす。もう一つの制限は、低沸点パーフルオロカーボン(PFC)ガスで安定な位相シフト液滴を生成する能力であり、これはvivo8での効率的な活性化に不可欠です。本稿では、生体内イメージングおよび治療用途のための安定したろ過低沸点気化可能な位相シフト液滴を生成するためのプロトコルが記載されている。
単分散サブミクロン位相シフト液滴7を製造する方法は多い。サイズを制御する最も堅牢な方法の1つは、マイクロ流体デバイスの使用です。これらのデバイスは、コストがかかり、液滴の生産速度が遅く(〜104-106液滴/s)7であり、広範なトレーニングが必要です。マイクロ流体デバイスは、一般に、システム7の自発的な気化や目詰まりを避けるために、高沸点ガスを必要とします。しかし、de Gracia Luxら.9の最近の研究では、マイクロフルダイザーを冷却して、低沸点デカフルオロブタン(DFB)またはオクターフルオロプロパン(OFP)を使用して高濃度のサブミクロン位相シフト(1010-1012/mL)を生成する方法を示しています。
一般に、DFBやOFPなどの低沸点ガスは、あらかじめ形成された気泡を使用して扱いやすくなっています。気化可能な液滴は、低温および上昇圧5,10を用いてガスを凝縮することにより、前駆体脂質安定化気泡から生成することができる。この方法を用いて生成される液滴の濃度は、前駆体マイクロバブル濃度と気泡から液滴への変換の効率に依存する。濃縮されたマイクロバブルは、1010 MB/mL11>近づく先端超音波処理から報告されているが、別の研究では、凝縮されたOFPおよびDFP気泡12から〜1〜3 x1011液滴/mLに及ぶ液滴濃度が報告されている。単分散液滴が懸念されない場合、凝縮方法は、低沸点PFCを使用して脂質安定化位相シフト液滴を生成する最も簡単で最も低コストの方法です。しかし、単分散前駆体気泡の発生も困難であり、マイクロ流体や繰り返し微分遠心分離技術などのより高価なアプローチを必要とする11。DFBおよびOFBナノ液滴を産生するための別のアプローチは、最近、リポソーム13における液滴の自発的核形成を用いて発表された。この方法は、「Ouzo」効果を利用して、気泡を凝縮することなく低沸点PFC液滴を生成する簡単な方法である。PFC液滴のサイズ分布は、液滴の核形成を開始するために使用されるPFC、脂質、およびエタノール成分を繊細な滴定および混合することによって制御することができる。また、パーフルオロカーボンの混合は、ナノ液滴14,15の安定性および活性化閾値を制御するために使用できることも注目に値する。Shakyaらの最近の研究は、炭化水素内の高沸点PFCsを炭化水素内の高沸点PfFCを乳化して、液滴コア16内の異種核形成を容易にすることによってナノドロップレット活性化を調整する方法を示している。
いったん形成されると、位相シフト液滴を形成後に押し出して、より多くの単分散集団を作り出すことができる。実際、ここで説明する方法と同様のプロトコルは、高沸点ドデデオフルオルペンタン(DDFP)を液滴コアとして使用してKopechekら17 によって以前に公開されている。高沸点パーフルオロカーボン(室温で安定)を有する位相シフト液滴を使用しようとする読者は、代わりに上記の記事を参照する必要があります。DFBやOFPなどの低沸点ガスを含む液滴の発生と押出は、より複雑であり、あらかじめ形成された気泡を凝縮させることで最もアプローチが可能です。
このプロトコルでは、プローブ先端超音波処理を用いてDFBガスコアを用いて事前に形成された脂質微小気泡を生成する一般的な方法が記載されている。次に、市販の押出機を使用して、プレフォームされたマイクロバブルをサブミクロン位相シフトナノ液滴に凝縮します(図1)。得られた液滴は、熱と超音波によって活性化可能である。この方法は、高価なマイクロ流体デバイスを必要とせずに、より狭いサイズ分布を有する従来の凝縮法よりも大量のナノ液滴溶液を生成することができる。狭いサイズ分布を持つナノドロップレット溶液の製造は、より均一な気化閾値を生成する可能性が高い。これは、画像処理、アブレーション、薬物送達、塞栓術1、3、4、6などの多数のアプリケーションの可能性を最大限に引き出します。
図1:予知されたマイクロバブルを位相シフトナノ液滴に凝縮するための高圧押出セットアップの概略図。 マイクロバブル溶液は押出機室に添加され、収容され、250psiは、窒素タンクから、チャンバー入口弁を通して適用される。窒素ガスは、マイクロバブル溶液をチャンバの基部のフィルターを通して押し出し、サンプルをナノ液滴に凝縮させる。溶液は最終的にサンプル出口管を通して押出機から押し出され、収集される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビボイメージングと治療のためのマイクロバブルと位相シフト液滴の処方、物理学、および潜在的な用途を議論する包括的な文献体が利用可能です。この議論は、脂質マイクロバブルを生成し、低沸点DFBガスと高圧押出を使用してサブミクロン位相シフト液滴に変換することに明示的に関連しています。ここで概説する方法は、従来のマイクロバブル凝縮法と液滴押出法を一回のステッ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
気化可能な位相シフトナノドロップレットのTRSP分析を提供してくれたケン・ホイト博士の研究室のドミニク・ジェームズに感謝したいと思います。
Materials
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | – | – | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | – | – | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | – | – | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | – | – | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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