Inflação do ar dos pulmões murinos com fixação vascular de perfusão

Summary

Apresentado é um método de inflação do ar com fixação vascular de perfusão dos pulmões que preserva a localização de células dentro das vias aéreas, alvéolos e interstícios para análises estrutura-função. A pressão constante das vias aéreas é mantida com uma câmara de inflação do ar, enquanto fixação é perfundida através do ventrículo direito. Pulmões são processados para estudos histológicos.

Abstract

A histologia pulmonar é frequentemente usada para investigar as contribuições fornecidas pelas células do espaço aéreo durante a homeostase pulmonar e a patogênese da doença. No entanto, métodos de fixação comumente usados baseados em instillação podem deslocar células do espaço aéreo e muco para vias aéreas terminais e podem alterar a morfologia tecidual. Em comparação, as técnicas vasculares de fixação da perfusão são superiores na preservação da localização e morfologia das células dentro dos espaços aéreos e do revestimento mucosal. No entanto, se a pressão positiva das vias aéreas não for aplicada simultaneamente, regiões dos pulmões podem entrar em colapso e capilares podem se aprofundar nos espaços alveolares, levando à distorção da anatomia pulmonar. Aqui, descrevemos um método barato para a inflação do ar durante a fixação da perfusão vascular para preservar a morfologia e localização das vias aéreas e células alveolares e interstício em pulmões murinos para estudos histológicos a jusante. A pressão de ar constante é entregue aos pulmões através da traqueia de uma câmara selada e cheia de ar que mantém a pressão através de uma coluna líquida ajustável enquanto fixação é perfundida através do ventrículo direito.

Introduction

A histologia pulmonar representa o padrão ouro para avaliar a arquitetura pulmonar durante a saúde e a doença e é uma das ferramentas mais utilizadas pelos pesquisadores pulmonares¹. Um dos aspectos mais críticos dessa técnica é o isolamento e preservação adequados do tecido pulmonar, uma vez que a variabilidade nesta etapa pode levar à má qualidade do tecido e resultados errôneos^1,2,3. Em animais vivos, o volume pulmonar é determinado pelo equilíbrio entre o recuo elástico interno do pulmão e as forças externas transmitidas da parede torácica e do diafragma pela tensão superficial. Assim, quando o tórax é introduzido, forças externas são perdidas e o pulmão entra em colapso. Seções histólógicas preparadas a partir de pulmões colapsados têm uma aparência lotada e as fronteiras entre compartimentos anatômicos (ou seja, espaços aéreos, vasculatura e interstício) podem ser difíceis de distinguir. Para contornar esse desafio, os pesquisadores frequentemente inflam os pulmões durante a fixação química para que o tamanho e a arquitetura do espaço aéreo seja mantido.

Os pulmões podem ser inflados com ar ou líquido. A pressão necessária para inflar os pulmões ao mesmo volume difere entre a inflação do ar e do líquido devido às forças intermoleculares na interface ar-líquido. Maior pressão (por exemplo, 25 cmH₂O) é necessária durante a inflação do ar do que a inflação líquida (por exemplo, 12 cmH₂O) para superar a tensão superficial e abrir o alvéolo colapsado⁴. Uma vez recrutados alvéolos, uma pressão mais baixa pode manter os alvéolos abertos ao mesmo volume que os platôs da curva de volume de pressão, e as pressões se igualam em todo o pulmão de acordo com a lei de Pascal^4,5,6,7,8.

Existem dois métodos principais de inflação e fixação pulmonar para preservar os pulmões murinos para a histologia. Mais comumente, os espaços aéreos são instilados com líquido – muitas vezes contendo um fixador. A principal vantagem dessa abordagem é que ela é relativamente fácil e requer pouco treinamento. Embora a instilação intratraqueal de fixação possa ser preferida em estudos que se concentram na vasculatura, o líquido que é incutido através da traqueia tende a empurrar células proximais das vias aéreas e mucinas para regiões mais distais do espaço aéreo, enquanto a inflação do ar não^{1,3,4,9,10,11}. Além disso, o desprendimento inadvertido de leucócitos do epitélio durante a inflação líquida altera sua morfologia, dando-lhes artefatosamente uma aparência simples e arredondada^4,10,11,12. Finalmente, a inflação dos pulmões com líquido pode comprimir involuntariamente o interstício^4,10,11. Juntos, esses fatores podem distorcer a anatomia normal e as distribuições celulares dentro dos pulmões preservados, limitando assim a técnica.

Um método alternativo de preservação do tecido é a fixação vascular da perfusão. Neste método, fixação é perfundida na vasculatura pulmonar através da veia cava ou do ventrículo direito. Este método preserva a localização e morfologia das células no lúmen do espaço aéreo. No entanto, a menos que os pulmões sejam inflados durante a fixação da perfusão, é provável que o tecido pulmonar entre em colapso.

A inflação do ar com fixação vascular de perfusão aproveita os pontos fortes de cada uma das técnicas de fixação acima. Aqui fornecemos um protocolo para esta técnica. Os materiais e equipamentos que são necessários são relativamente baratos e podem ser facilmente obtidos e montados. A configuração completa, mostrada na Figura 1A,fornece pressão constante das vias aéreas para os pulmões por meio de uma coluna ajustável e cheia de fluidos, enquanto uma bomba peristáltica fornece fixação através do ventrículo direito. Pulmões com morfologia preservada podem então ser processados para análises estruturais-função.

Protocol

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Saúde Nacional Judaica. NOTA: O protocolo é organizado em três componentes. O primeiro componente detalha a construção da inflação do ar com equipamento de perfusão/fixação. Uma segunda seção descreve como configurar o equipamento para um experimento. A seção final descreve como preparar o animal e realizar o experimento. 1. Cons…

Representative Results

Em um tórax intacto, os pulmões são mantidos abertos por forças externas aplicadas pela parede do peito através do espaço pleural6,14. Quando o diafragma é introduzido durante a dissecção, a integridade do espaço pleural é abolida e os pulmões devem entrar em colapso(Figura 2A, 2B). Para rees expander os pulmões, a inflação do ar é realizada. Como primeiro passo, 25 cm de pressão da água são aplica…

Discussion

Embora comumente usados, métodos de fixação baseados em intratraqueal deslocam leucócitos das vias aéreas e podem alterar a arquitetura pulmonar normal. O método de inflação do ar com fixação vascular de perfusão que é fornecido neste protocolo supera essas armadilhas e preserva com mais precisão a anatomia pulmonar. As chaves para obter tecido de alta qualidade a partir do método de fixação vascular da perfusão incluem o monitoramento cuidadoso das pressões da inflação do ar, evitar vazamentos de ar …

Materials

00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	Stopcock
BD 60 mL syringe, slip tip	BD	309654	Syringe used to construct the water column
BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8	BD Biosciences	305122	Needle for vascular perfusion/fixation
Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	Female Luer
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3393	Heparin solution.
Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge	BD Biosciences	427564	Luer-Stub Adapter
Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee	Nordson Medical	LT787-9	Male Luer
Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing	ThermoFisher Scientific	8000-9020	Tubing
Paraformaldehyde Aqueous Solution – 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline
Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker	Permatex	81724	Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV	Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions
Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container	Sterilite	0342	Animal processing container