同種の抗体を用いた二重標識免疫蛍光による宿主と病原体の相互作用の研究
Summary
ここで、プロトコルは、宿主と病原体の相互作用を研究するために同じ種で生起される一次抗体を用いて二重標識免疫蛍光を行う方法を説明する。また、このプロトコルには、別の宿主からの第3の抗体を含むことができる。このアプローチは、任意の細胞型および病原体で行うことができる。
Abstract
今日では、寄生虫と宿主の細胞相互作用を研究するために利用可能な幅広い分子ツールを見つけることが可能です。しかし、寄生虫の中で特定の細胞構造およびタンパク質を認識する商業的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を得るためにいくつかの制限がある。また、トリパノソマチドの標識に利用できる市販の抗体はほとんどありません。通常、寄生虫に対するポリクローナル抗体は、社内で調製され、同じ種で産生される他の抗体と組み合わせて使用することはより困難である可能性があります。ここで、プロトコルは、同じ種で育てられたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を使用して、宿主細胞および病原体相互作用を研究するために二重標識免疫蛍光を行う方法を示す。二重標識免疫蛍光を達成するためには、まずマウスポリクローナル抗体をインキュベートし、次に二次マウスIgG抗体を任意の蛍光色に結合してインキュベーションに従うことは重要です。その後、次の二次抗体によって一次抗体の痕跡が認識されるのを防ぐために、追加のブロッキングステップが必要です。次に、マウスモノクローナル抗体とその特異的IgGサブクラス二次抗体を別のフルオロクロームに結合させ、適宜にサンプルに添加する。さらに、異なる種で上げられた第3の抗体を用いて三重標識免疫蛍光を行うことが可能である。また、核やアクチンなどの構造は、その後、それらの特定の化合物またはラベルで染色することができます。したがって、ここで提示されるこれらのアプローチは、一次抗体の供給源が限られている任意の細胞に対して調整することができる。
Introduction
病原体と宿主細胞との相互作用を細胞レベルで研究するために、ウイルス、細菌、原虫などの異なるグループがほとんどの宿主細胞タイプ1,2,3,4に感染する可能性があるため、疾患の根本的な原因に関する必須情報を提供する。また、病原体の成長を遅らせるか阻害する可能性のある治療標的を開発し、同定するのにも役立ちます。生きた条件では、産生された抗体は自己成分、ウイルスからの抗原、細菌成分または製品、真菌、寄生虫、および他の人を認識する責任がある5。
このため、抗体は、主に細胞構造およびタンパク質の位置および機能を理解するために広く使用されているツールである。複数の抗体標識を用いたいくつかの研究は、追加のブロッキングステップが免疫局在の特異性に寄与することを示している。さらに、ほとんどの記載されたプロトコルは、同じ宿主種からの抗体を含む特定の商業的モノクローナル抗体を使用する6,7,8,9,10,11,12,13,14。
通常、二重標識免疫蛍光は、異なる種で生起された2つの抗体を使用して、目的の細胞構造または病原体および宿主細胞間の相互作用を見るために染色する。しかし、これは、一部の病原体に特異的な市販のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が二重標識を行う利用できない場合に問題となる可能性がある。また、市販の抗体コンジュゲーションキットがあり、かつ、一次抗体をスクシニミジルエステル反応15によって直接フルオロフォアに結合させることができる。問題は、これらのキットはしばしば高価であり、ラベルを付けるのに十分な抗体が必要であるということです。これを知りながら、トリパノソーマbrucei16でタンパク質の局在を研究するために、同じ種で育てられた2つの異なる抗体を用いた二重免疫蛍光法の開発に成功しました。しかし、トリパノソーマクルシを含む細胞内寄生虫については、このアプローチは実証されていない。ここでは、クロス反応を伴わずに同種で生起した一次抗体を用いて細胞内T.クルジ寄生虫および宿主細胞を研究するために二重標識免疫蛍光を行う方法を示す。この方法に加えて、異なる種からの第3抗体を添加して三重免疫蛍光標識が確立されている。これらのアプローチは、抗体の供給源が限られており、任意の細胞タイプで使用できる場合に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、同じ宿主種の2つの異なる抗体を用いて 、トリパノソーマ・クルジ 感染細胞において二重免疫標識を行うプロトコルを提示する。研究するために、より詳細に、感染の影響を、核または細胞質小器官などの宿主細胞内の構造は、このプロトコルを用いて標識することができる。また、後埋め薄いセクション免疫金標識法にも使用できる。このアプローチは、トリパノソマチ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フンダソン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP 2010/19547-1;; 2018/03677-5)からMMABへ、フンダサン・デ・アポオ・アオ・エンシーノ、ペスキサ・エ・アシストエンシア-FAEPAからMMAB、そしてクオルデナソン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーベル・スーペリア・ブラジル(CAPES) – ファイナンス・コード0011。CG-CはCAPESから修士と博士の交わりを受け、LAMT-SはCNPqから博士課程のフェローシップを受けました。共焦点顕微鏡支援のイライザベテ・R・ミラニと、LLC-MK2細胞(USPリベイラオ・プレト医科大学)を提供してくれたダリオ・ザンボニ博士に感謝します。
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
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