Dubbele etikettering van immunofluorescentie met behulp van antilichamen van dezelfde soort om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen
Summary
Hier beschrijft het protocol hoe dubbele labeling immunofluorescentie kan worden uitgevoerd met behulp van primaire antilichamen die in dezelfde soort zijn grootgebracht om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen. Ook kan het het derde antilichaam van een andere gastheer in dit protocol opnemen. Deze aanpak kan worden gemaakt in elk celtype en pathogenen.
Abstract
Tegenwoordig is het mogelijk om een breed scala aan moleculaire hulpmiddelen te vinden die beschikbaar zijn om parasiet-gastheer celinteracties te bestuderen. Er zijn echter enkele beperkingen om commerciële monoklonale of polyklonale antilichamen te verkrijgen die specifieke celstructuren en eiwitten in parasieten herkennen. Bovendien zijn er weinig commerciële antilichamen beschikbaar om trypanosomatiden te labelen. Meestal worden polyklonale antilichamen tegen parasieten in eigen huis bereid en kunnen ze moeilijker te gebruiken zijn in combinatie met andere antilichamen die in dezelfde soort worden geproduceerd. Hier demonstreert het protocol hoe polyklonale en monoklonale antilichamen die in dezelfde soort zijn gekweekt, kunnen worden gebruikt om dubbele etikettering van immunofluorescentie uit te voeren om gastheercel- en pathogeeninteracties te bestuderen. Om de dubbele labeling immunofluorescentie te bereiken, is het cruciaal om eerst het polyklonale antilichaam van de muis te incuberen en vervolgens de incubatie te volgen met het secundaire muis IgG-antilichaam geconjugeerd aan elk fluorochroom. Daarna is een extra blokkerende stap nodig om te voorkomen dat sporen van het primaire antilichaam worden herkend door het volgende secundaire antilichaam. Vervolgens worden een monoklonaal antilichaam van de muis en zijn specifieke IgG-subklasse secundair antilichaam geconjugeerd aan een ander fluorochroom op de juiste tijdstippen aan het monster toegevoegd. Bovendien is het mogelijk om drievoudige etikettering van immunofluorescentie uit te voeren met behulp van een derde antilichaam dat in een andere soort is opgewekt. Ook kunnen structuren zoals kernen en actine vervolgens worden gekleurd met hun specifieke verbindingen of labels. Deze hier gepresenteerde benaderingen kunnen dus worden aangepast voor elke cel waarvan de bronnen van primaire antilichamen beperkt zijn.
Introduction
Het bestuderen van de interactie van de ziekteverwekker met de gastheercel op cellulair niveau biedt essentiële informatie over de onderliggende oorzaken van de ziekte, aangezien verschillende groepen, zoals virussen, bacteriën en protozoa, de meeste gastheerceltypen kunnen infecteren1,2,3,4. Het kan ook helpen bij het ontwikkelen en identificeren van potentiële therapeutische doelen die de groei van de ziekteverwekker kunnen vertragen of remmen. In levende omstandigheden zijn de geproduceerde antilichamen verantwoordelijk voor het herkennen van zelfcomponenten, antigenen van virussen, bacteriële componenten of producten, schimmels, parasieten en anderen5.
Voor dit doel zijn antilichamen veel gebruikte hulpmiddelen, voornamelijk voor het begrijpen van de locatie en functie van cellulaire structuren en eiwitten. Verschillende studies met behulp van meervoudige antilichaametikettering tonen aan dat extra blokkerende stappen bijdragen aan de specificiteit van de immunolokalisatie. Bovendien gebruiken de meeste beschreven protocollen specifieke commerciële monoklonale antilichamen, waaronder antilichamen van dezelfde gastheersoort6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Gewoonlijk gebruikt dubbele labeling immunofluorescentie twee antilichamen die in verschillende soorten zijn grootgebracht om de celstructuren van belang of de pathogenen en de gastheercellen te kleuren om de interactie tussen hen te zien. Dit kan echter een probleem zijn wanneer er geen commerciële monoklonale of polyklonale antilichamen specifiek voor sommige pathogenen beschikbaar zijn om de dubbele etikettering uit te voeren. Ook zijn er in de handel verkrijgbare antilichaamconjugatiekits en is het mogelijk om de primaire antilichamen rechtstreeks aan de fluorofoor te conjugeren door een succinimidylesterreactie15. Het probleem is dat deze kits vaak duur zijn en dat het noodzakelijk is om voldoende antilichamen te hebben om ze te labelen. Dit wetende, hebben we met succes een dubbele immunofluorescentiemethode ontwikkeld met behulp van twee verschillende antilichamen die in dezelfde soort zijn gekweekt om eiwitlokalisatie in Trypanosoma brucei16 te bestuderen. Voor intracellulaire parasieten, waaronder Trypanosoma cruzi, is deze aanpak echter niet aangetoond. Hier laten we zien hoe dubbele labeling immunofluorescentie kan worden uitgevoerd om intracellulaire T. cruzi-parasieten en de gastheercel te bestuderen met behulp van primaire antilichamen die in dezelfde soort zijn opgewekt zonder kruisreacties. Naast deze methode is een drievoudige immunofluorescentie-etikettering vastgesteld met toevoeging van het derde antilichaam van een andere soort. Deze benaderingen helpen wanneer de bron van antilichamen beperkt is en kunnen in elk celtype worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een protocol om dubbele immunolabeling uit te voeren in trypanosoma cruzi geïnfecteerde cellen met behulp van twee verschillende antilichamen van dezelfde gastheersoort. Om, met meer detail, de implicaties van de infectie te bestuderen, kunnen structuren in de gastheercel zoals de kern of cytosolische organellen worden gelabeld met behulp van dit protocol. Het kan ook worden gebruikt in de post-embedding dunne sectie immunogold labeling methode. Deze aanpak helpt om het obstakel te overwinne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) aan MMAB, door Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA aan MMAB en door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – financieringscode 001. CG-C ontving een master- en doctoraatsbeurs van CAPES en LAMT-S ontving een doctoraatsbeurs van CNPq. We bedanken Elizabete R. Milani voor confocale microscopie-assistentie en Dr. Dario Zamboni voor het leveren van LLC-MK2-cellen (Ribeirao Preto Medical School, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
References
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
- Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
- Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
- Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
- Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
- Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
- McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
- Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
- Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
- Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
- Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
- de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
- Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
- Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
- Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
- Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
- Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
- Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).
