मुराइन सिनोट्रियल और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड से निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का अलगाव और संस्कृति
Summary
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल माउस दिल के सिनोट्रियल नोड (एसएएन) और एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) क्षेत्र से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के अलगाव के लिए एक चरण-दर-चरण दृष्टिकोण प्रदान करता है।
Abstract
हृदय में विद्युत चालन को सुविधाजनक बनाने के लिए निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का प्रदर्शन किया गया है। फिजियोलॉजिकल हृदय ताल को सिनोएट्रियल नोड (एसएएन) में उत्पन्न विद्युत आवेगों द्वारा शुरू किया जाता है और फिर एट्रिओवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) के माध्यम से वेंट्रिकल्स में आयोजित किया जाता है। कार्डियक चालन प्रणाली में निवासी मैक्रोफेज की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए, सैन और एवीएन से निवासी मैक्रोफेज का उचित अलगाव आवश्यक है, लेकिन यह चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यहां, हम निवासी मैक्रोफेज के अलगाव और संस्कृति के बाद मुराइन दिलों में सैन और एवीएन के विश्वसनीय सूक्ष्म विच्छेदन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
दोनों, सैन जो क्रिस्टा टर्मिनल के जंक्शन पर बेहतर वेना कावा के साथ स्थित है, और एवीएन जो कोच के त्रिकोण के शीर्ष पर स्थित है, की पहचान की जाती है और सूक्ष्म विच्छेदन किया जाता है। मैसन के ट्राइक्रोम दाग के साथ और एंटी-एचसीएन 4 द्वारा किए गए ऊतक के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा सही स्थान की पुष्टि की जाती है।
माइक्रोविच्छेदित ऊतकों को तब एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है, जिसके बाद इनक्यूबेशन सेल-प्रकार विशिष्ट सतह मार्करों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के एक विशिष्ट पैनल के साथ होता है। यह फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा विभिन्न सेल आबादी की पहचान, गिनती या अलग करने की अनुमति देता है। मायोकार्डियम में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए, विशेष रूप से भर्ती मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, एक नाजुक तैयार गेटिंग रणनीति की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, लिम्फोइड वंश कोशिकाओं का पता लगाया जाता है और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा जाता है। फिर, माइलॉयड कोशिकाओं की पहचान निवासी मैक्रोफेज के साथ की जाती है जो सीडी 45 और सीडी 11 बी दोनों की उच्च अभिव्यक्ति और एलवाई 6 सी की कम अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित की जाती है। सेल सॉर्टिंग के साथ, पृथक कार्डियक मैक्रोफेज को आगे की जांच के लिए कई दिनों तक विट्रो में खेती की जा सकती है। इसलिए, हम कार्डियक चालन प्रणाली के भीतर स्थित कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सैन और एवीएन को माइक्रोडिसेक करने और पचाने में नुकसान पर चर्चा करते हैं, और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कार्डियक मैक्रोफेज को विश्वसनीय रूप से पहचानने, गिनती करने और सॉर्ट करने के लिए एक गेटिंग रणनीति प्रदान करते हैं।
Introduction
साइनोएट्रियल नोड (सैन) शारीरिक रूप से विद्युत आवेग शुरू करता है और इसलिए, हृदय का प्राथमिक पेसमेकर है। एट्रियोवेंट्रिकुलर नोड (एवीएन) एट्रिया से वेंट्रिकल्स तक विद्युत आवेग का संचालन करता है और सहायक पेसमेकर1 के रूप में भी कार्य करता है। सामान्य तौर पर, विद्युत आवेगों का उत्पादन और चालन एक जटिल प्रक्रिया है जिसे सैन / एवीएन क्षेत्रों में निवासी मैक्रोफेज सहित विभिन्नकारकों 2 द्वारा संशोधित किया जा सकता है। हुल्समैन्स एट अल द्वारा हाल ही में किए गए एक अध्ययन में कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की एक विशिष्ट आबादी प्रदर्शित होती है जो एवीएन में समृद्ध होते हैं औरस्थिर दिल की धड़कन को बनाए रखने में प्रमुख खिलाड़ियों के रूप में कार्य करते हैं। उन्होंने पाया कि मैक्रोफेज कार्डियोमायोसाइट्स के साथ विद्युत रूप से युग्मित होते हैं और युग्मित कार्डियोमायोसाइट्स के विद्युत गुणों को बदल सकते हैं। लेखकों ने यह भी ध्यान दिया कि मैक्रोफेज के साथ इंटरलीविंग ऐसी संचालन कोशिकाएं कार्डियक चालन प्रणाली के अन्य घटकों में भी मौजूद हैं, जैसे कि सैन।
वर्तमान में, यह पूरी तरह से ज्ञात नहीं है कि निवासी कार्डियक मैक्रोफेज का फेनोटाइप हृदय क्षेत्रों के बीच भिन्न होता है या नहीं। हालांकि, यह दिखाया गया है कि ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट ऊतक मैक्रोफेज4 के प्रतिलेखन और प्रोलिफेरेटिव नवीकरण को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, चूंकि कार्डियोमायोसाइट्स फेनोटाइप को क्षेत्रों के बीच अलग-अलग दिखाया गया है, कार्डियोमायोसाइट्स पर मैक्रोफेज के कार्यात्मक प्रभाव भी क्षेत्र-विशिष्ट हो सकते हैं, भले ही मैक्रोफेज फेनोटाइप स्वयं समान हो। इसलिए, विशिष्ट हृदय क्षेत्रों पर आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि, स्थिर अवस्था में, ऊतक निवासी मैक्रोफेज प्रसवपूर्व रूप से स्थापित होते हैं, जो निश्चित हेमटोपोइजिस से स्वतंत्र रूप से उत्पन्न होते हैं, और वयस्कता5 में बने रहते हैं। हालांकि, मैक्रोफेज की कमी के बाद या हृदय की सूजन के दौरान, लाइ6सीहाय मोनोसाइट्स कार्डियक मैक्रोफेज आबादी 6 को फिर से भरनेमें योगदान करते हैं। आनुवंशिक वंश अनुरेखण, पैराबायोसिस, भाग्य मानचित्रण और सेल ट्रैकिंग से जुड़े अध्ययनों ने अंगों और ऊतकों में विभिन्न प्रकार के ऊतक निवासी मैक्रोफेज आबादी के सह-अस्तित्व को दिखाया, और, मैक्रोफेज उपसमुच्चय के विभिन्न सेलुलर व्यवहार जो संभावित रूप से उनके ऑन्टोजेनी 7,8,9 से जुड़े हैं।
निवासी कार्डियक मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन ने चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) और फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग के उपयोग से लाभ उठाया है। ये विधियां विशेष रूप से विशिष्ट सेल आबादी को उनके सेल सतह मार्करों के साथ लेबल करके कई ऊतक अंशों से अलग करने के लिए उपयोगी हैं। यह न केवल पृथक प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार की उच्च शुद्धता की ओर जाता है, बल्कि फेनोटाइपिक विश्लेषण की भी अनुमति देता है। यहां, हम विशेष रूप से सैन और एवीएन क्षेत्र से अलग कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के संवर्धन के लिए फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टिंग के साथ चुंबकीय मोती-लेपित कोशिकाओं सहित एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
चालन प्रणाली में कार्डियक निवासी मैक्रोफेज की विशेषताओं और कार्डियक चालन और अरिदमोजेनेसिस के लिए उनके कार्य का पता लगाने के लिए, सैन और एवीएन का सटीक स्थानीयकरण और विच्छेदन महत्वपूर्ण है। सैन और एवीएन के सूक्ष्म विच्छेदन के लिए, क्षेत्र पहचान10 के लिए शारीरिक स्थलों का उपयोग किया जाता है। संक्षेप में, सैन बेहतर वेना कावा और दाएं आलिंद के जंक्शन पर स्थित है। एवीएन कोच के त्रिकोण के भीतर स्थित है, जो ट्राइकसपिड वाल्व के सेप्टल पत्रक से घिरा हुआ है, और पीछे की ओर टोडारो11 के कण्डरा से घिरा हुआ है। हम चूहों में सैन और एवीएन की एक सटीक सूक्ष्म विच्छेदन प्रक्रिया भी प्रदान करते हैं जो हिस्टोलॉजी और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की जाती है।
पृथक निवासी मैक्रोफेज का उपयोग आरएनए अनुक्रमण जैसे आगे के प्रयोगों के लिए किया जा सकता है या विभिन्न इन विट्रो प्रयोगों की अनुमति देने वाले दो सप्ताह से अधिक समय तक पुनर्प्राप्त और खेती की जा सकती है। इसलिए, हमारा प्रोटोकॉल इम्यूनो-रिदमोलॉजिस्ट के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान प्रक्रिया का वर्णन करता है। तालिका 1 आवश्यक सभी समाधानों की संरचना को दर्शाती है, चित्र 1 सैन और एवीएन के लिए माइक्रोडिसेक्शन लैंडमार्क दिखाता है। चित्रा 2 सैन और एवीएन स्थानीयकरण का योजनाबद्ध चित्रण है। चित्रा 3 सैन और एवीएन (मैसन के ट्राइक्रोम और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला) के हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन को दर्शाता है। चित्रा 4 प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग द्वारा कार्डियक निवासी मैक्रोफेज को अलग करने के लिए एक चरण-दर-चरण गेटिंग रणनीति दिखाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम विशेष रूप से उच्च शुद्धता पर सैन और एवीएन क्षेत्रों से कार्डियक निवासी मैक्रोफेज के संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
मैक्रोफेज को उनके शारीरिक स्थान और का?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को चीन छात्रवृत्ति परिषद (सीएससी, से आर ज़िया), जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेडएचके; 81X2600255 से एस क्लॉस, 81Z0600206 से S. Kab, 81Z0600204 से C.S.S.), कोरोना फाउंडेशन (S199/10079/2019 से S. C. C.S. पांडुलिपि तैयार करने में फंड की कोई भूमिका नहीं थी।
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
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