Выделение и культивирование резидентных сердечных макрофагов из мышиного синоатриального и атриовентрикулярного узла
Summary
Протокол, представленный здесь, обеспечивает пошаговый подход к выделению сердечных резидентных макрофагов из области синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) мышечных сердец.
Abstract
Было продемонстрировано, что резидентные сердечные макрофаги облегчают электрическую проводимость в сердце. Физиологический сердечный ритм инициируется электрическими импульсами, генерируемыми в синоатриальном узле (SAN), а затем проводится к желудочкам через атриовентрикулярный узел (AVN). Для дальнейшего изучения роли резидентных макрофагов в системе сердечной проводимости необходима правильная изоляция резидентных макрофагов от SAN и AVN, но это остается сложной задачей. Здесь мы предоставляем протокол для надежной микродиссекции SAN и AVN в сердцах мышей с последующей изоляцией и культивированием резидентных макрофагов.
Как SAN, который расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, так и AVN, который расположен на вершине треугольника Коха, идентифицируются и микрорассекаются. Правильное расположение подтверждается гистологическим анализом ткани, выполненным с помощью трихромного пятна Массона и анти-HCN4.
Затем микродиссеченные ткани ферментативно перевариваются с получением одноклеточных суспензий с последующей инкубацией со специфической панелью антител, направленных против специфических поверхностных маркеров клеточного типа. Это позволяет идентифицировать, подсчитывать или изолировать различные клеточные популяции с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток. Чтобы дифференцировать сердечные резидентные макрофаги от других иммунных клеток в миокарде, особенно от макрофагов, полученных из моноцитов, необходима деликатная разработанная стратегия гатирования. Во-первых, клетки лимфоидной линии обнаруживаются и исключаются из дальнейшего анализа. Затем миелоидные клетки идентифицируются с резидентными макрофагами, определяемыми высокой экспрессией как CD45, так и CD11b, и низкой экспрессией Ly6C. При сортировке клеток изолированные сердечные макрофаги затем могут культивироваться in vitro в течение нескольких дней для дальнейшего исследования. Поэтому мы описываем протокол выделения сердечных резидентных макрофагов, расположенных в системе сердечной проводимости. Мы обсуждаем подводные камни в микрорассекании и переваривании SAN и AVN, а также предоставляем стратегию захвата для надежной идентификации, подсчета и сортировки сердечных макрофагов с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток.
Introduction
Синоатриальный узел (SAN) физиологически инициирует электрический импульс и, следовательно, является основным кардиостимулятором сердца. Атриовентрикулярный узел (AVN) проводит электрический импульс от предсердий к желудочкам, а также действует как вспомогательный кардиостимулятор1. В целом, генерация и проведение электрических импульсов является сложным процессом, который может модулироваться различными факторами2, включая резидентный макрофаг в областях SAN/AVN. Недавнее исследование Hulsmans et al. демонстрирует специфическую популяцию сердечных резидентных макрофагов, которые обогащены AVN и функционируют как ключевые игроки в поддержании устойчивого сердцебиения3. Они обнаружили, что макрофаги электрически связаны с кардиомиоцитами и могут изменять электрические свойства связанных кардиомиоцитов. Авторы также отмечают, что такие проводящие клетки, чередующиеся с макрофагами, присутствуют и в других компонентах системы сердечной проводимости, таких как SAN.
В настоящее время до конца не известно, отличается ли фенотип резидентных сердечных макрофагов между сердечными областями. Однако было показано, что микроокружение тканей может влиять на транскрипцию и пролиферативное обновление тканевых макрофагов4. Кроме того, поскольку было продемонстрировано, что фенотип кардиомиоцитов различается между областями, функциональное воздействие макрофагов на кардиомиоциты также может быть специфичным для региона, даже если сам фенотип макрофага может быть одинаковым. Поэтому необходимы дальнейшие исследования конкретных сердечных областей.
Недавние исследования показали, что в устойчивом состоянии тканевые резидентные макрофаги устанавливаются пренатально, возникая независимо от окончательного кроветворения, и сохраняются во взрослом возрасте5. Однако после истощения макрофагов или во время воспаления сердца моноциты Ly6chi способствуют пополнению популяции макрофагов сердца6. Исследования, включающие отслеживание генетической линии, парабиоз, картирование судьбы и отслеживание клеток, показали сосуществование различных популяций макрофагов-резидентов тканей в органах и тканях, а также различное клеточное поведение подмножеств макрофагов, которые потенциально связаны с их онтогенезом 7,8,9.
Характеристика резидентных сердечных макрофагов выиграла от использования магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) и флуоресцентной активированной сортировки клеток. Эти методы особенно полезны для выделения специфических клеточных популяций из нескольких тканевых фракций путем маркировки их маркерами клеточной поверхности. Это не только приводит к более высокой чистоте изолированного типа иммунных клеток, но и позволяет проводить фенотипический анализ. Здесь мы представляем протокол, включающий магнитные клетки, покрытые шариками, с последующей флуоресцентной активированной сортировкой клеток для обогащения сердечных резидентных макрофагов, специально выделенных из области SAN и AVN.
Для изучения характеристик сердечных резидентных макрофагов в проводящей системе и их функции для сердечной проводимости и аритмогенеза решающее значение имеют точная локализация и рассечение SAN и AVN. Для микродиссекции SAN и AVN для идентификации региона10 используются анатомические ориентиры. Короче говоря, SAN расположен на стыке верхней полой вены и правого предсердия. AVN расположен в треугольнике Коха, который спереди граничит с перегородочным листком трикуспидального клапана, а сзади сухожилием Тодаро11. Мы также предоставляем точную процедуру микродиссекции SAN и AVN у мышей, что подтверждается гистологическим и иммунофлуоресцентным окрашиванием.
Изолированные резидентные макрофаги могут быть использованы для дальнейших экспериментов, таких как секвенирование РНК, или могут быть восстановлены и культивированы в течение более двух недель, что позволяет проводить различные эксперименты in vitro. Поэтому наш протокол описывает очень ценную процедуру для иммуноритмолога. В таблице 1 показан состав всех необходимых решений, на рисунке 1 показаны ориентиры микродиссекции для SAN и AVN. На рисунке 2 приведена схематическая иллюстрация локализации SAN и AVN. На рисунке 3 показано гистологическое окрашивание SAN и AVN (трихромное и иммунофлуоресцентное окрашивание Массона). На рисунке 4 показана пошаговая стратегия гатинга для изоляции сердечных резидентных макрофагов путем флуоресцентно-активированной сортировки клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описываем протокол обогащения сердечных резидентных макрофагов конкретно из областей SAN и AVN с высокой чистотой.
Макрофаги делятся на субпопуляции в зависимости от их анатомического расположения и функционального фенотипа. Они также могут переключат?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Китайским стипендиальным советом (CSC, R. Xia), Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для S. Clauss, 81Z0600206 для S. Kääb, 81Z0600204 для C.S.), Фондом Corona (S199/10079/2019 для S. Clauss), SFB 914 (проект Z01 для S. Massberg), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для S. Clauss) и Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (для S. Clauss). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
