Isolierung und Kultur residenter kardialer Makrophagen aus dem murinen sinoatrialen und atrioventrikulären Knoten
Summary
Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen schrittweisen Ansatz für die Isolierung von kardialen residenten Makrophagen aus der Region des Sinusknotens (SAN) und des atrioventrikulären Knotens (AVN) von Mäuseherzen.
Abstract
Es wurde gezeigt, dass residente Herzmakrophagen die elektrische Leitung im Herzen erleichtern. Der physiologische Herzrhythmus wird durch elektrische Impulse initiiert, die im Sinusknoten (SAN) erzeugt und dann über den atrioventrikulären Knoten (AVN) zu den Ventrikeln geleitet werden. Um die Rolle residenter Makrophagen im Herzleitungssystem weiter zu untersuchen, ist eine ordnungsgemäße Isolierung der residenten Makrophagen aus SAN und AVN erforderlich, bleibt jedoch eine Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll für die zuverlässige Mikrodissektion des SAN und AVN in murinen Herzen zur Verfügung, gefolgt von der Isolierung und Kultur residenter Makrophagen.
Sowohl SAN, das sich an der Kreuzung des Crista-Terminalis mit der oberen Hohlvene befindet, als auch AVN, das sich an der Spitze des Koch-Dreiecks befindet, werden identifiziert und mikroseziert. Die korrekte Lokalisation wird durch histologische Analyse des Gewebes bestätigt, die mit Massons Trichrom-Färbung und durch Anti-HCN4 durchgeführt wird.
Mikrosezierte Gewebe werden dann enzymatisch verdaut, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, gefolgt von der Inkubation mit einem spezifischen Panel von Antikörpern, die gegen zelltypspezifische Oberflächenmarker gerichtet sind. Dies ermöglicht es, verschiedene Zellpopulationen durch fluoreszierend aktivierte Zellsortierung zu identifizieren, zu zählen oder zu isolieren. Um kardiale residente Makrophagen von anderen Immunzellen im Myokard zu unterscheiden, insbesondere von rekrutierten Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, ist eine sorgfältig entwickelte Gating-Strategie erforderlich. Zunächst werden lymphatische Linienzellen nachgewiesen und von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Dann werden myeloische Zellen mit residenten Makrophagen identifiziert, die durch eine hohe Expression von CD45 und CD11b und eine niedrige Expression von Ly6C bestimmt werden. Mit der Zellsortierung können dann isolierte Herzmakrophagen über mehrere Tage in vitro kultiviert werden, um weitere Untersuchungen durchzuführen. Wir beschreiben daher ein Protokoll zur Isolierung kardialer Makrophagen, die sich innerhalb des Herzleitungssystems befinden. Wir diskutieren Fallstricke bei der Mikrozerlegung und Verdauung von SAN und AVN und bieten eine Gating-Strategie zur zuverlässigen Identifizierung, Zählung und Sortierung von Herzmakrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung.
Introduction
Der Sinusknoten (SAN) initiiert physiologisch den elektrischen Impuls und ist somit der primäre Schrittmacher des Herzens. Der atrioventrikuläre Knoten (AVN) leitet den elektrischen Impuls von den Vorhöfen zu den Ventrikeln und fungiert auch als Hilfsschrittmacher1. Im Allgemeinen ist die Erzeugung und Leitung elektrischer Impulse ein komplexer Prozess, der durch verschiedene Faktoren2 moduliert werden kann, einschließlich residenter Makrophagen in SAN/AVN-Regionen. Eine aktuelle Studie von Hulsmans et al. zeigt eine spezifische Population von kardialen residenten Makrophagen, die im AVN angereichert sind und als Schlüsselakteure bei der Aufrechterhaltung eines gleichmäßigen Herzschlags fungieren3. Sie fanden heraus, dass Makrophagen elektrisch an die Kardiomyozyten gekoppelt sind und die elektrischen Eigenschaften gekoppelter Kardiomyozyten verändern könnten. Die Autoren stellen auch fest, dass solche leitenden Zellen, die mit Makrophagen verschachtelt sind, auch in anderen Komponenten des Herzleitungssystems, wie dem SAN, vorhanden sind.
Derzeit ist nicht vollständig bekannt, ob sich der Phänotyp der residenten Herzmakrophagen zwischen den Herzregionen unterscheidet. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Mikroumgebung des Gewebes die Transkription und proliferative Erneuerung von Gewebemakrophagen beeinflussen kann4. Da der Kardiomyozyten-Phänotyp zwischen den Regionen unterschiedlich ist, können die funktionellen Wirkungen von Makrophagen auf Kardiomyozyten auch regionsspezifisch sein, auch wenn der Makrophagen-Phänotyp selbst derselbe sein kann. Daher sind weitere Studien zu bestimmten Herzregionen erforderlich.
Neuere Studien haben gezeigt, dass die geweberesidenten Makrophagen im Steady State pränatal etabliert sind, unabhängig von der definitiven Hämatopoese entstehen und bis ins Erwachsenenalter bestehenbleiben 5. Nach Makrophagen-Depletion oder während einer Herzentzündung tragen Ly6c-Hi-Monozyten jedoch zur Auffüllung der kardialen Makrophagenpopulation bei6. Studien zur genetischen Abstammungsverfolgung, Parabiose, Schicksalskartierung und Zellverfolgung zeigten die Koexistenz einer Vielzahl von geweberesidenten Makrophagenpopulationen in Organen und Geweben sowie ein unterschiedliches zelluläres Verhalten von Makrophagen-Untergruppen, die möglicherweise mit ihrer Ontogenese assoziiert sind 7,8,9.
Die Charakterisierung residenter kardialer Makrophagen hat von der Verwendung von magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) und fluoreszierend aktivierter Zellsortierung profitiert. Diese Methoden sind besonders nützlich, um bestimmte Zellpopulationen aus mehreren Gewebefraktionen zu isolieren, indem sie mit ihren Zelloberflächenmarkern markiert werden. Dies führt nicht nur zu einer höheren Reinheit des isolierten Immunzelltyps, sondern ermöglicht auch eine phänotypische Analyse. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit magnetisch perlenbeschichteten Zellen, gefolgt von fluoreszierend aktivierter Zellsortierung zur Anreicherung von kardialen residenten Makrophagen, die spezifisch aus der SAN- und AVN-Region isoliert wurden.
Um die Eigenschaften von kardialen residenten Makrophagen im Leitungssystem und ihre Funktion für die Herzleitung und Arrhythmogenese zu untersuchen, ist eine präzise Lokalisierung und Dissektion von SAN und AVN von entscheidender Bedeutung. Für die Mikrodissektion von SAN und AVN werden anatomische Landmarken für die Regionsidentifikation10 verwendet. Kurz gesagt, SAN befindet sich an der Kreuzung der oberen Hohlvene und des rechten Vorhofs. AVN befindet sich im Dreieck von Koch, das anterior durch das Septumblatt der Trikuspidalklappe und posterior durch die Sehne von Todaro11 begrenzt wird. Wir bieten auch ein genaues Mikrodissektionsverfahren von SAN und AVN in Mäusen, das durch Histologie und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt wird.
Isolierte residente Makrophagen könnten für weitere Experimente wie RNA-Sequenzierung verwendet oder für mehr als zwei Wochen geborgen und kultiviert werden, was verschiedene In-vitro-Experimente ermöglicht. Daher beschreibt unser Protokoll ein sehr wertvolles Verfahren für den Immunrhythmologen. Tabelle 1 zeigt die Zusammensetzung aller benötigten Lösungen, Abbildung 1 zeigt die Mikrodissektions-Orientierungspunkte für SAN und AVN. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der SAN- und AVN-Lokalisierung. Abbildung 3 zeigt die histologische Färbung von SAN und AVN (Masson-Trichrom- und Immunfluoreszenzfärbung). Abbildung 4 zeigt eine Schritt-für-Schritt-Gating-Strategie zur Isolierung kardialresidenter Makrophagen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Anreicherung von kardialen residenten Makrophagen speziell aus den SAN- und AVN-Regionen in hoher Reinheit.
Makrophagen werden basierend auf ihrer anatomischen Lage und ihrem funktionellen Phänotyp in Subpopulationen unterteilt. Sie können auch von einem funktionellen Phänotyp auf einen anderen als Reaktion auf variable Mikroumgebungssignale umschalten13. Im Vergleich zu anderen Organen wie Knochenmark und Leber …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt wurde diese Arbeit vom China Scholarship Council (CSC, an R. Xia), vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss, 81Z0600206 an S. Kääb, 81Z0600204 an C.S.), der Corona Foundation (S199/10079/2019 an S. Clauss), dem SFB 914 (Teilprojekt Z01 an S. Massberg), dem ERA-NET on Cardiovascular Diseases (ERA-CVD; 01KL1910 to S. Clauss) und der Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (an S. Clauss). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
