이 문서는 주입 캐뉼라와 마우스의 해마의 CA1 영역에 이식으로 보충 된 맞춤형 이미징 창의 준비를 보여줍니다.
깨어 있는 행동 동물에 있는 단세포 해상도에 있는 신경 활동을 화상 진찰하는 것은 시스템 신경 과학에 있는 신경 회로 기능의 조사를 위한 아주 강력한 접근입니다. 그러나, 포유류 조직에 있는 높은 흡광도 및 산란은 주로 피상적인 두뇌 지구에 생명 화상 진찰을 제한하고, 해마와 같은 깊은 두뇌 영역을 떠나, 광학 현미경 검사법에 대한 손이 닿지 않는 곳에 둡니까. 이 비디오에서는, 헤드 고정 행동 마우스에서 등쪽 해마 CA1 영역의 만성 생체 내 이미징을 가능하게 하기 위해 맞춤형 이미징 창의 준비 및 이식을 보여줍니다. 맞춤형 창은 이미징 영역에 바이러스 벡터와 약물의 표적 전달을 허용하는 주입 캐뉼라로 보완됩니다. 이 준비를 와이드 필드 이미징과 결합함으로써, 우리는 몇 주 동안 마우스를 행동하는 뉴런의 큰 하위 세트에서 형광 칼슘 지표를 사용하여 신경 활동의 장기 기록을 수행했습니다. 또한 단일 스파이크 해상도를 갖춘 전압 이미징을 위한 이 준비의 적용 가능성을 입증했습니다. 신경 활동과 과학 CMOS 카메라의 고성능 유전적으로 인코딩된 지표는 높은 시간적 해상도에서 단일 뉴런의 세포 전형 학적 세부 사항의 재발적인 시각화를 허용했습니다. 우리는 또한 기술된 방법의 장점 및 잠재적인 한계 및 그밖 화상 진찰 기술과의 호환성에 대해 토론합니다.
해마는 학습및 기억1뿐만 아니라 공간 탐색2를담당하는 주요 뇌 영역입니다. 해마 위축은 기억 상실 및 인지기능저하3,4,5와 관련된 신경 학적 및 정신 질환과 관련이있습니다. 마우스에서, 해마는 세포 및 네트워크 수준4,5에공간, 문맥, 및 연관 학습 및 메모리 형성을 연구하는 아주 잘 확립된 모델이다. 학습과 메모리의 기계적인 연구는 신경 구조와 쥐를 행동하는 기능의 세로 심문이 필요합니다. 유전적으로 인코딩된 프로브6과 결합된 형광 이미징 은 막 전압 역학7,8,칼슘 과도9,뉴런의 대형 하위 집합에 대한 구조적 변화10을 유전적으로 기록할 수 있는 전례 없는 기능을 제공합니다. 그러나, 마우스에 있는 해마에 광학 접근은 두께에 있는 1 mm 이상에 도달할 수 있는 피질에 의해 방해됩니다. 여기서, 우리는 마우스를 행동하는 등쪽 해마의 CA1 하위 영역에 장기 광학 접근을 위해 맞춤형 이미징 장치와 만성 이식을 마우스 헤드로 조립하는 절차를 설명했습니다. 이미징 임플란트에 통합된 주입 캐뉼라를 사용하면 시야의 뉴런에 직접 바이러스 또는 약물을 투여할 수 있습니다. 넓은 필드 현미경 검사법과 함께 설명된 준비는 오랜 기간 동안 마우스를 행동하는 뉴런의 큰 하위 집합의 재발성 이미징을 가능하게 합니다. 우리는 단일 세포 해상도에서 신경 활동 기록을 위한 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 표적 주입을 통해 해마 CA1 지역에서 칼슘 및 전압 유전으로 인코딩된 지표를 표현하기 위해 이 준비를 활용했습니다. 우리는 또한 동물을 행동하는 높은 현면 적 해상도에서 해당 신경 하위 집합의 세로 칼슘 이미징을 수행했습니다. 또한, 이러한 제제는 다광석 현미경 검사법과 미세내시경과 호환되므로, 마우스를 행동하는 세포 및 세포외 수준에서 신경망을 연구하기 위해 이미징 기술의 툴박스를 더욱 확장한다. 우리는 프로토콜의 중요한 단계와 문제 해결을 설명했습니다. 우리는 또한 방법의 가능한 함정과 한계에 대해 논의했다.
여기서 우리는 행동 마우스에서 해마 CA1 영역의 장기 화상 진찰을 위한 방법을 기술합니다. 이 방법은 맞춤형 이미징 창의 만성 이식에 기초하여, 이는 또한 관심의 뉴런에 직접 바이러스 또는 약물의 표적 투여를 가능하게. 본 프로토콜은 네 가지 주요 부분으로 구성됩니다: i) 이미징 임플란트의 조립; ii) 이미징 임플란트 설치; iii) 이미징 임플란트를 통한 바이러스 주입; iv) 면도 마우스에서 기능성 이미징. 아래에서 는 프로토콜의 중요한 단계, 문제 해결, 수정 및 메서드의 제한 사항을 설명하고 설명합니다. 우리는 또한 방법과 잠재적 인 대체 응용 프로그램의 중요성에 대해 논의합니다.
성공적인 수술을 위해 오히려 중요한 기술된 프로토콜에 있는 몇몇 중요한 단계가 있습니다: (i) 고품질 화상 진찰 임플란트의 준비; (ii) 멸균 수술 조건; (iii) 피질의 포부; (iv) 이미징 임플란트의 정확한 배치; (v) 바이러스 주사. 1.6 단계에서 말했듯이, 과도한 납땜 주석은 더 큰 두개 통 절제술을 필요로하므로 염증의 위험을 증가시킵니다. 또한 1.11단계에서 나타난 바와 같이, 이미징 캐뉼라에 커버 글래스를 고정할 때 적정량의 접착 광학 접착제를 사용하는 것이 매우 중요하며, 불충분한 양은 뇌척수액을 이미징 캐뉼라로 누출시키고 불투명하게 만들 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 한편, 과도한 광학 접착제는 유리 창의 투명도가 저하될 수 있다. 이미징 임플란트의 가능한 오염은 광학 창 및/또는 심한 염증 하에서 결합 조직의 활성 증식을 일으킬 수 있으며, 이는 실험의 조기 종료로 이어질 것입니다. 따라서 수술 전에 임플란트 조립 및 준비를 이미징하는 것은 수술 자체만큼이나 중요합니다.
수술 도중, 두개골 절제술의 밑에 피질의 부분은 피할 수 없는 출혈을 초래하는 온화한 포부에 의해 abD됩니다. 수술 부위의 혈액은 제거해야 하는 뇌 조직의 가시성을 크게 감소시킵니다. 이것은 조직 절제의 요구되는 깊이의 정확한 평가를 복잡하게 합니다. 조직의 다음 부분을 제거하기 위해 흡입을 적용하기 전에 매번 PBS와 수술 부위의 주의 깊은 홍조는 깊이의 더 나은 제어를 제공합니다. 뇌 조직은 항상 더 많은 흡입을 진행하기 전에 ablated 조직의 깊이를 확인하는 단계별로 작은 부분에서 제거해야합니다. 흡입의 미세한 제어는 또한 얇은 무딘 바늘로 달성 될 수있다. 우리는 26 G 바늘을 사용하는 것이 좋습니다, 그러나, 26 G 직경보다 작은 막히는 경향이있다. 더욱이, 피질, 코퍼스 캘로섬 및 해마의 색이 마우스에서 마우스로 다를 수 있기 때문에, 각 동물에게 필요한 포부의 정확한 깊이를 결정하기 위해 많은 연습이필요하다(그림 3).
이미징 임플란트의 삽입 및 고정은 해마의 등대 표면에 이미징 창의 가장 가까운 위치를 보장하기 위해 매우 정확하게 수행해야합니다. 준비된 두개골 절제술의 크기는 임플란트와 밀접하게 일치하고 상당한 저항없이 삽입을 허용해야합니다. 동시에, 적절한 밀봉을 보장하고 뇌 조직 노출을 피하기 위해 두개골과 임플란트 사이에 눈에 보이는 간격이 없어야합니다. 부드럽고 안정적인 압력은 두개골에 밀봉하는 동안 임플란트의 상단에 적용해야합니다. 임플란트 설치 중 이미징 창 아래에 혈액이 있는 것은 거의 피할 수 없습니다. 외과 적 수술이 제대로 완료되면 창은 3-7 일 후에 꺼져야하며 뇌 혈관이 명확하게 보입니다. 바이러스가 창 아래에 제대로 주입되도록하는 것도 중요합니다. 발현이 실패하면 바이러스를 여러 번 재주입할 수 있다.
어떤 경우에는 우리가 만난 주요 합병증은 이미징 창의 가시성을 감소시면 됩니다. 가난한 이미징 품질에 대 한 몇 가지 가능한 이유가 있다: i) 지속적인 염증; ii) 유리에 결합 조직의 파생; iii) 창과 해마 사이의 큰 간격. 염증은 일반적으로 수술 중 또는 제대로 살균되지 않은 이미징 임플란트에 의해 오염에 의해 발생합니다. 우리는 각 수술 전후 수술 기구를 자동화하고, 수술 직전에 수술 부위를 소독하고, 수술 중에 깨끗한 개인 보호 장비를 착용하는 것이 좋습니다. 이미징 임플란트는 조립, 살균 및 멸균 상태로 저장한 후 세척해야 합니다. 화상 진찰 임플란트의 유리에 결합 조직의 파생은 피질 절제 도중 유리의 표면에 기계적 오염 또는 과도한 외상 때문일 수 있습니다. 임플란트를 조립한 후 유리 표면이 깨끗하고 매끄럽게 유지되도록 하는 것이 중요합니다. 또한, 손상된 뇌 조직의 모든 조각은 두개골 절제술에 이미징 임플란트를 삽입하기 전에 주의 깊게 제거해야합니다. 경우에 따라 유리 창과 해마 사이의 간격으로 뇌척수액이 축적되어 이미징의 품질이 저하됩니다. 따라서 임플란트 설치 시 해마와 유리 창 사이의 좋은 접촉을 보장하는 데 모든 방법을 삽입하는 것이 중요합니다. 때로는 불투명한 이미징 창의 정확한 이유를 식별하기가 어렵습니다. 우리는 광학 창에서 조건을 드러내고 그에 상응하는 후속 수술을 조정하기 위하여 사후 분석을 능력을 발휘하는 것이 좋습니다.
이 방법은 생체 내 이미징 전과 도중 고려해야 할 몇 가지 기본 및 기술적 한계가 있습니다. 주요 한계 중 하나는 피질 절제입니다. 시각 및 감각 피질의 일부가 수술 중에 제거됩니다. 피질 절제의 영향을 정확하게 평가하기는 어렵지만, 제거된 뇌 조직이 해마에 직접 투사하지 않기 때문에, 여러 연구는 해마 의존학습 또는 기타 관련 해마기능(15,16)의눈에 띄는 손상을 입증하지 못했다. 특히 높은 NA 객관적렌즈를 사용할 때광학적 한계도 고려해야 합니다. 예를 들어, 이 연구에서는 1.9mm 의 내경을 가진 1.75mm 길이의 캐뉼라를 사용했습니다. 이 캐뉼라의 지오메트리는 NA ~0.5 이상의 공기 목표 또는 NA가 ~0.6 이상의 빛으로 표시되기 때문에 물 목표의 전체 NA를 보존하지 않습니다. 모든 뇌 이미징 임플란트에 대한 일반적인 또 다른 제한은 뇌의 일부가 노출되어 열 손실17,18을촉진한다는 것입니다. 그러나, 생리적 뇌 온도는 따뜻한 완충제의 관류에 의해 이미징 중에 쉽게 복원 될 수있다.
설명된 방법은 다른 응용 프로그램에 대해 쉽게 수정하거나 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 준비는 striatum7의이미징을 위해 적응될 수 있다. 줄무늬가 해마보다 약간 더 깊어짐에 따라, 더 긴 이미징 캐뉼라를 이미징 임플란트 조립에 사용해야 합니다. 우리는 2.0 mm 화상 진찰 캐뉼라를 사용하는 것이 좋습니다. 두개골 절제술의 좌표는 그에 따라 조정되어야합니다 (AP : +0.8 mm, ML : -1.8 mm). 또한, 주입 캐뉼라를 통한 바이러스 주사는 제한된확산을가진 AAV 혈청형을 사용할 때 뉴런의 얇은 층에서 트랜스진의 발현을 달성할 수 있게 한다19,20. 그것은 더 깊은 층에서 초점 불소 감소 때문에 1 광자 화상 진찰에 특히 유익하고, 그 결과로, 향상한 단세포 해상도 화상 진찰. 더욱이, 주사 캐뉼라는 또한 FOV(도5B)의뉴런에 직접 약물 또는 기타 화학 물질의 투여를 위한 기능적 이미징 중에 사용될 수 있다. 전반적인 주입 캐뉼라는 이미징 임플란트에 유용한 기능을 추가하여 표적 바이러스 발현으로 인한 이미징 품질을 개선하고 FOV에서 뉴런의 약리자극을 가능하게 합니다. 사용된 헤드 플레이트는 러닝머신에서 동물을 활발하게 움직이는 경우에도 모션 아티팩트를 최소화하는 이미징 임플란트의 탁월한 안정성을 제공합니다. 헤드 플레이트는 작고 가볍기 때문에 동물에게 최소한의 불편함을 주며 설치 후 몇 달 동안 안정적으로 유지됩니다. 이미징 임플란트는 또한 다광화상영상(15,16,21)과 호환되며, 마이크로내시경(22,23)과결합될 수 있다. 유사한 이미징 임플란트는 또한 층 라디툼, 층 라쿠노스 및 덴테이트 자이러스16,24, 25,26,27을포함하여 깊은 해마 구조의 다광 화상 진찰에 사용되었다. 그러나, 주입 캐뉼라를 통해 AAV를 가진 더 깊은 해마 구조물을 표적으로 하는 것은 AAV 혈청형 및 부피19의추가 최적화를 요구할 수 있다.
우리는 기술된 프로토콜이 간단하고 적당한 1광화상 화상 진찰 설정을 사용하여 마우스를 행동하는 마우스의 해마에 있는 높은 현면 적 해상도를 가진 신경 활동을 조사하는 것을 목표로 하는 연구를 촉진할 것이라는 점을 믿습니다.
The authors have nothing to disclose.
웨스트레이크 대학의 분자 생물 공학 그룹의 모든 구성원에게 모든 도움과 유용한 토론을 감사드립니다. 웨스트레이크대학의 리진제와 지민지아에게도 수술 촬영에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.
이 작품은 웨스트 레이크 대학, 2020 BBRF 젊은 조사관 그랜트, 중국 국립 자연 과학 재단이 K.D.P.에 모든 32050410298 보조금의 기초 기금에 의해 지원되었다.
Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
denture base resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |