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Biology

Vierfach-Schachbrett: Eine Modifikation des dreidimensionalen Schachbretts zur Untersuchung von Arzneimittelkombinationen

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62311
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand, 2Department of Clinical Microbiology, Michigan Health Clinics, 3College of Medicine, Central Michigan University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie alle möglichen Kombinationen untersucht werden können, die zwischen vier Medikamenten in einem einzigen Experiment erhalten werden können. Diese Methode basiert auf dem Standard-96-Well-Platten-Mikroverdünnungsassay und der Berechnung fraktionaler inhibitorischer Konzentrationen (FICs) zur Bewertung der Ergebnisse.

Abstract

Das Konzept der Arzneimittel-Kombinationstherapie gewinnt vor allem mit der drastischen Zunahme der Arzneimittelresistenz an Bedeutung. Das Quadruple Checkerboard, auch Q-Checkerboard genannt, zielt darauf ab, die Anzahl der möglichen Kombinationen zu maximieren, die zwischen vier Medikamenten in einem Experiment erhalten werden können, um die Zeit und Arbeit zu minimieren, die erforderlich sind, um die gleichen Ergebnisse mit anderen Protokollen zu erzielen. Dieses Protokoll basiert auf der einfachen Mikroverdünnungstechnik, bei der die Medikamente verdünnt und in mehreren 96-Well-Platten kombiniert werden.

Im ersten Satz von 96-Well-Platten wird Muller-Hinton-Brühe hinzugefügt, gefolgt von dem ersten erforderlichen Medikament (z. B. Cefotaxim hier), um es seriell zu verdünnen. Nachdem der erste Schritt abgeschlossen ist, wird ein weiterer Satz von 96-Well-Platten verwendet, um das zweite Medikament (z. B. Amikaci) zu verdünnen, das durch Entfernen eines bestimmten Volumens von Medikament 2 übertragen und in die entsprechenden Vertiefungen in den ersten Satz von 96-Well-Platten, die Medikament eins enthalten, gelegt wird. Der dritte Schritt erfolgt durch Zugabe der erforderlichen Konzentrationen des dritten Arzneimittels (z. B. Levofloxacin) zu den entsprechenden Platten im Ausgangssatz, der die Kombination von Arzneimittel 1 und 2 enthält. Der vierte Schritt erfolgt durch Zugabe der erforderlichen Konzentrationen des vierten Arzneimittels (z. B. Trimethoprim-Sulfamethoxazol) in die entsprechenden Platten im ersten Satz. Dann wird E. coli ESBL bakterielles Inokum hergestellt und hinzugefügt.

Diese Methode ist wichtig, um alle möglichen Kombinationen zu bewerten und hat ein breiteres Spektrum an Möglichkeiten, die darüber hinaus für In-vivo-Tests getestet werden können. Obwohl es sich um eine ermüdende Technik handelt, die viel Konzentration erfordert, sind die Ergebnisse bemerkenswert und zeitsparend, wo viele Kombinationen in einem einzigen Experiment getestet werden können.

Introduction

Mit der Zunahme der Resistenz aufgrund des übermäßigen Einsatzes und Missbrauchs von Antibiotika1,2ist die Notwendigkeit, neue Medikamente und Mittel zur Behandlung bakterieller Infektionen zu entwickeln, entscheidend geworden. Neue Ansätze wie die Entwicklung neuer Medikamente sind sehr wichtig, um die Resistenzkrise zu überwinden. Die pharmaindustrie ist jedoch nicht daran interessiert, neue antimikrobielle Wirkstoffe zu entwickeln. Darüber hinaus werden sich Bakterien, wenn neue Medikamente entwickelt werden, weiterentwickeln und Resistenzen gegen diese neuen Medikamente entwickeln3,4. Somit wird das Problem der Resistenz nicht gelöst, was die Notwendigkeit eines anderen Ansatzes zu einem Muss macht, das in Betracht gezogen und untersucht werden sollte, um bakterielle Resistenzen zu überwinden.

Die Arzneimittelkombination ist ein sehr wichtiges Konzept zur Behandlung bakterieller Infektionen, hauptsächlich solche, die durch multiresistente Erreger verursacht werden5,6. Es verringert den Verlauf der Behandlung, verringert die verabreichte Dosis; So hilft die Verringerung der Toxizität des gegebenen Arzneimittels, die Rate der Resistenzentwicklung zu verringern und sensibilisiert in gewisser Weise die Bakterien für die gegebenen Arzneimittel, wie im Konzept der Kollateralempfindlichkeit5,7,8,9beschrieben .

Die Entwicklung von Resistenzen gegen ein Medikament erfordert eine einzige Mutation; Die Entwicklung von Resistenzen gegen eine Kombination von Medikamenten, die auf mehrere Signalwege abzielen, erfordert jedoch mehrere unabhängige Mutationen, die durch diese Kombination verlangsamt werden. Ein Beispiel für eine verminderte Resistenz während der Kombinationstherapie ist die verminderte Resistenzrate gegen Rifampin bei Mycobacterium Tuberculosis10. Ein weiteres Beispiel ist eine Studie von Gribble et al., die zeigte, dass die Rate des Auftretens resistenter Stämme bei Patienten, die Piperacillin allein einnehmen, höher ist als bei Patienten, die eine Kombination aus Carboxypenicillin und Aminoglycosid10einnehmen. Studien haben gezeigt, dass die Entwicklung von Resistenzen gegen Aminoglykoside in sich entwickelnden Bakterien diese Stämme empfindlich gegenüber verschiedenen anderen Medikamenten machte5. Die Kombination zwischen dem Beta-Lactam-Klasse-Medikament Amoxicillin und dem Lactamase-Inhibitor Clavulansäure zeigte Erfolge bei der Behandlung resistenter Bakterienstämme8.

Die Verkürzung der Behandlungszeit ist ein guter Vorteil, der sich aus Arzneimittelkombinationen ergibt. Zum Beispiel wird eine Therapie von kombiniertem Penicillin oder Ceftriaxon mit Gentamicin für 2 Wochen die gleiche Wirksamkeit von Penicillin oder Ceftriaxon allein geben, wenn es für 4 Wochen11gegeben wird. Die Kombination von Medikamenten ermöglicht die Verwendung niedrigerer Dosierungen von Medikamenten, die nicht wirksam sind, wenn sie allein verabreicht werden, wie die Sub-MICs. Das Beispiel von Sulfonamiden kann gegeben werden, wenn die Verwendung von Tripelsulfonamiden bei niedrigeren Dosen die Toxizität minimiert, die bei der Verwendung unlöslicher Sulfonamide in vollen Dosen entsteht12.

So wird die Verringerung der verabreichten Dosierung und der Behandlungszeit schließlich die Toxizität der Medikamente auf dem Körper verringern. Die Idee, Methoden zu entwickeln, um die Wechselwirkung zwischen kombinierten Medikamenten zu bewerten, ist sehr wichtig. In einer Studie zeigten die Ergebnisse, dass die Kombinationstherapie bei der Behandlung resistenter Arten von Acinetobacter und P. aeruginosa wirksamerist8.

Medikamente in Kombination verern
Es gibt verschiedene Methoden, mit denen wir Arzneimittelkombinationen untersuchen können, wie die Schachbrettmethode, die Time-Kill-Kurvenmethode und die E-Testmethode13. Die Schachbrettmethode kann alle möglichen Kombinationen zwischen den beiden fraglichen Medikamenten in einem Experiment selbst untersuchen. Darüber hinaus wurde es entwickelt, um eine Kombination von drei Medikamenten14zu untersuchen. Nun erweitern wir dies, um eine Kombination von vier Medikamenten hauptsächlich zur Behandlung von multiresistenten Krankheitserregern zu untersuchen.

Der Time-Kill-Curve-Assay wird normalerweise durchgeführt, um die bakterizide Wirkung eines bestimmten Arzneimittels zu testen. Es wurde auch verwendet, um die Wirkung von Arzneimittelkombinationen zu testen, bei denen mehrere Medikamente in bestimmten Konzentrationen kombiniert werden. Dieses Protokoll erfordert die Herstellung mehrerer steriler Röhrchen oder Becher, in denen wir in jede Tasse die Brühe, die Kombination von Medikamenten und den erforderlichen Bakterienstamm hinzufügen. Nach Inkubation und Aufzeichnung der optischen Dichte zu mehreren Zeitpunkten werden die Ergebnisse mit der normalen Wachstumsrate der verwendeten Sorte verglichen, um zu sehen, ob die Wachstumsrate zugenommen, abgenommen oder sich nicht verändert hat13.

Die E-Test-Methode wird normalerweise durchgeführt, um auf die minimale hemmende Konzentration (MIC) zu testen, bei der ein Streifen, der eine Gradientenkonzentration des betreffenden Arzneimittels enthält, auf eine geimpfte Platte gelegt wird. Es wurde auch verwendet, um die Kombination zwischen zwei Medikamenten zu testen, bei denen zwei Streifen senkrecht zur Platte hinzugefügt werden, die sich an ihren MICs13schneiden.

Laut Literatur gibt es keinen Goldstandard, um Synergien zu definieren und zu untersuchen; Daher ist es schwierig zu beurteilen, welche der Methoden, die zur Untersuchung der Kombination verwendet werden, besser ist und welche bessere und zuverlässigere Ergebnisse liefert, hauptsächlich13. Der Time-Kill-Assay ist jedoch arbeitsintensiv, zeitaufwendig und teuer15,16, während die E-Test-Methode entwickelt wurde, um nur eine Kombination zwischen zwei Medikamenten zu untersuchen. Checkerboard kann alle möglichen Kombinationen zwischen den beiden getesteten Medikamenten untersuchen und deshalb wurde diese Technik ausgewählt, um entwickelt zu werden.

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Protocol

1. Vorbereitungsschritte

  1. Muller-Hinton-Brühe (MHB) zubereiten, indem Sie 25 g MH-Brühe zu 1 L destilliertem Wasser geben und mischen. Autoklav bei 121 °C für 2,5 h. Anschließend lagern Sie die autoklavierten Medien bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank.
  2. Subkulturieren Sie die betreffenden Bakterien (E. coli ESBL) auf dem Agarmedium mit der Vier-Quadranten-Streifenmethode und inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C.
    1. Nehmen Sie mit einer sterilen Schlaufe eine Kolonie und verteilen Sie sie in der ersten Hälfte der MacConkey-Agarplatte, indem Sie enge parallele Streifen machen.
    2. Verteilen Sie mit der Schleife die Bakterien im zweiten Quadranten, indem Sie sie aus dem ersten Quadranten streifen.
    3. Verlängern Sie vom zweiten Quadranten aus die Streifen im dritten Quadranten mit engen parallelen Streifen.
    4. Verbreiten Sie die Bakterien in der Mitte des vierten Quadranten, indem Sie sie aus dem dritten Quadranten streifen.

2. Vorbereitung des Panels

  1. Platzieren Sie vier 96-Well-Platten nebeneinander, um ein Quadrat zu bilden. Kleben Sie ihren Boden mit einem Band zusammen.
  2. Wiederholen Sie diesen Schritt, um vier Panels mit jeweils 4 Platten zu erhalten und sie A1, A2, A3 und A4 zu nennen.
  3. 50 μL MH-Brühe in die Vertiefungen zwischen Spalte 2 und Spalte 11 in den 16 96-Well-Platten der vier Paneele geben.
  4. Fügen Sie 200 μL MH-Brühe in die Vertiefung H12 ein, die als Negativkontrollbohrung in den 16 96-Well-Platten der vier Panels dient.
  5. Fügen Sie 150 μL MH-Brühe zu den Vertiefungen A1 und H1 hinzu, die als Positivkontrollbrunnen in den 16 96-Well-Platten der vier Panels dienen.

3. Medikament 1, Cefotaxim, serielle Verdünnung

  1. In ein konisches Röhrchen werden 15 ml sterilesdH2O gegeben.
    1. Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 15 mL) / C1.
      HINWEIS: In unserem Fall beträgt die Cefotaxim-Stammlösung 105 μg / ml und C2 256 μg / ml; somitV1 = 38,4 μL.
  2. Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 15 ml sterilem dH2O und fügen Sie dann das Medikament hinzu.
  3. 50 μL der hergestellten Wirkstofflösung werden in jede Vertiefung in Spalte 11 und Spalte 12 außer H12 pipetten.
  4. Beginnen Sie die serielle Verdünnung, indem Sie 50 μL aus Spalte 11 entfernen und in die entsprechenden Vertiefungen in Spalte 10 und dann von 10 bis zum Erreichen von Spalte 2 geben, wo die 50 μL aus Spalte 2 verworfen werden.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 für alle 16 96-Well-Platten der vier Panels.

4. Medikament 2, Amkacin, serielle Verdünnung

  1. In ein konisches Röhrchen werden 10 ml sterilesdH2O gegeben.
  2. Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 10 mL) / C1.
    HINWEIS: In unserem Fall beträgt die Amikacin-Stammlösung 103 μg/ml undC2 64 μg/ml; somitV1 = 64 μL.
  3. Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 10 ml sterilem dH2O und fügen Sie dann das Medikament hinzu.
  4. Nehmen Sie acht separate 96-Well-Platten.
  5. Zu jeder Platte werden 100 μL MHB zu den Vertiefungen zwischen den Reihen G und B hinzugefügt.
  6. 100 μL der zuvor hergestellten Wirkstoff-2-Lösung in die Vertiefungen der Reihe G geben.
  7. Verdünnen Sie seriell von Zeile G nach Reihe B, indem Sie 100 μL aus jeder Vertiefung nehmen und schließlich die 100 μL aus den Vertiefungen von Reihe B verwerfen.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 4.5, 4.6 und 4.7, um acht Platten vorzubereiten.

5. Übertragung von Medikament 2 auf die vier Panels

  1. Pipetten Sie 50 μL des Arzneimittels 2 aus den Vertiefungen zwischen den Reihen G und B in die entsprechenden Vertiefungen in jeder Platte in den vier Paneelen. Eine vorbereitete 96-Well-Platte enthält 100 μL Medikament 2, was für zwei Platten in einem Panel ausreicht.

6. Arzneimittel 3, Levofloxacin, Zusatz

  1. Zu vier verschiedenen konischen Röhrchen werden 14 ml sterilesdH2Ohinzugefügt.
  2. Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 14 mL) / C1.
    HINWEIS: In unserem Fall wird Levofloxacin in vier verschiedenen Konzentrationen aus einer Stammlösung von 5 x 103 μg/ml hergestellt.
    C1 = 2 μg/ml, V1 = 5,6 μL
    C2 = 4 μg/ml,V1 = 11,2 μL
    C3 = 8 μg/ml, V1 = 22,4 μL
    C4 = 16 μg/ml, V1 = 44,8 μL
  3. Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 14 ml sterilem dH2O aus jedem Röhrchen und fügen Sie dann das Medikament hinzu.
  4. Nach der Herstellung der erforderlichen Konzentrationen des dritten Arzneimittels nehmen Sie 50 μL und fügen Sie es den entsprechenden Vertiefungen zwischen den Reihen B und G und den Spalten 2 und 12 in der entsprechenden Platte in jeder Platte hinzu, wobei C1 den vier P1-Platten in den vier Platten entspricht, C2 entspricht den vier P2-Platten in den vier Platten C3 entspricht den vier P3-Platten in den vier Panels und C4 entspricht den vier P4-Platten in den vier Panels.

7. Arzneimittel 4, Trimethoprim-Sulfamethoxazol, Zusatz

  1. In ein konisches Röhrchen werden 14 ml sterilesdH2O gegeben.
  2. Berechnen Sie das Volumen, das aus der Stammlösung des Arzneimittels nach der FormelC1V1 =C2 V2entfernt werdensoll. Somit istV1 = (C2 x 14 mL) / C1.
    HINWEIS: In unserem Fall wird Trimethoprim-Sulfamethoxazol in vier verschiedenen Konzentrationen aus einer Stammlösung von 48 x 103 μg/ml hergestellt.
    C1 = 512 μg/ml, V1 = 149,33 μL
    C2 = 1024 μg/ml, V1 = 298,66 μL
    C3 = 2048 μg/ml, V1 = 597,33 μL
    C4 = 4096 μg/ml, V1 = 1 194,66 μL
  3. Entfernen Sie das berechnete Volumen aus den 14 ml sterilem dH2O jedes Röhrchens und fügen Sie dann das Medikament hinzu.
  4. Nach der Vorbereitung der erforderlichen Konzentrationen des vierten Arzneimittels nehmen Sie 50 μL und fügen Sie es den entsprechenden Vertiefungen zwischen den Reihen B und G und den Spalten 2 und 12 in den vier Platten des entsprechenden Panels hinzu, wobei C1 Panel 1, C2 Panel 2, C3 Panel 3 und C4 Panel 4 entspricht.

8. Herstellung und Zugabe von bakteriellem Inoculum E. coli ESBL

  1. Übertragen Sie mit einer sterilen Schleife eine Kolonie des Bakterienisolats E. coli ESBL, das zuvor auf einer Platte kultiviert wurde, in 2 ml steriles MHB und Wirbel.
  2. Überprüfen Sie die Trübung, wo sie 0,5 McFarland mit einem Densitometer betragen sollte.
  3. Fügen Sie 80 ml sterile MH-Brühe in einen sterilen Urinbecher hinzu.
  4. Bakterielles Inokum aus dem 0,5 McFarland Inokum in den Urinbecher nachC1V1 =C2V2hinzufügen, wobeiV1 = (106 x 80 ml) / 108 = 800 μL.
  5. Pipette 50 μL der Inokkulumlösung 106 KBE/ml in jede Vertiefung außer H12, die die Sterilitätskontrollbohrung ist.
  6. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C über Nacht.
  7. Nach der Inkubation 50 μL Iodotetrazolium hinzufügen, um das Wachstum in den Vertiefungen aufzuzeichnen.

9. Protokoll für die FIC-Vorlage (Supplemental File)

  1. Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 1 (Cefotaxim) in die gelbe Zelle in Panel A.
  2. Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 2 (Amikacin) in die gelbe Zelle in Panel B.
  3. Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 3 (Levofloxacin) in die gelbe Zelle in Panel C.
  4. Schreiben Sie die höchste Konzentration von Medikament 4 (Trimethoprim-Sulfamethoxazol) in Panel D.
  5. Verfolgen Sie die rote Linie (Growth/no Growth interface), indem Sie die Bohrbrunnen mit Wachstum rot hervorheben.
  6. Schreiben Sie das MIC von Medikament 1 in die Tabelle von Medikament 1 (ATB1).
  7. Schreiben Sie das MIC von Medikament 2 in die Tabelle von Medikament 2 (ATB2).
  8. Schreiben Sie das MIC von Medikament 3 in die Tabelle von Medikament 3 (ATB3).
  9. Schreiben Sie das MIC von Medikament 4 in die Tabelle von Medikament 4 (ATB4).
  10. So berechnen Sie FIC für ATB1
    1. Bestimmen Sie die Vertiefungen auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum.
    2. Doppelklicken Sie in Tabelle ATB1 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Bedienfeld A an die erste ausgewählte Vertiefung.
    3. Wiederholen Sie Schritt 9.10.2 für jede ausgewählte Vertiefung, bei der Vertiefung 1 FIC1, Vertiefung 2 FIC2 usw. entspricht.
  11. So berechnen Sie den FIC für ATB2
    1. Doppelklicken Sie in tabelle ATB2 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Feld B zur ersten vorausgewählten Vertiefung.
    2. Wiederholen Sie Schritt 9.11.1 für jede vorausgewählte Vertiefung.
  12. So berechnen Sie den FIC für ATB3
    1. Doppelklicken Sie in Tabelle ATB3 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Bedienfeld C zur ersten vorausgewählten Vertiefung.
    2. Wiederholen Sie Schritt 9.12.1 für jede vorausgewählte Vertiefung.
  13. So berechnen Sie den FIC für ATB4
    1. Doppelklicken Sie in Tabelle ATB4 auf die Zelle neben FIC1 und ziehen Sie die gelbe Zelle links neben Feld D zur ersten vorausgewählten Vertiefung.
    2. Wiederholen Sie Schritt 9.13.1 für jede vorausgewählte Vertiefung.
  14. Summieren Sie in der Tabelle atB1+2+3+4 automatisch den FIC1 jedes ATB. Dasselbe gilt für die anderen FICs (FIC2, FIC3 usw.).
    1. Doppelklicken Sie in der Zelle, die FIC enthält und gelb hervorgehoben ist, darauf und wählen Sie die summierten ΣFICs aus der Tabelle ATB1+2+3+4 aus.
  15. Wiederholen Sie diese Schritte für jedes der neun Blätter, die die neun Blätter darstellen.
    HINWEIS: Im Blatt FIC all zeigt die Tabelle den endgültigen summierten FIC mit der Interpretation des erhaltenen Wertes.

10. MIC-Bestimmung mit dem Mikrodilutionsassay für die vier Medikamente

  1. Kennzeichnen Sie vier verschiedene Zeilen mit der Abkürzung jedes getesteten Medikaments. Zum Beispiel CTX für Cefotaxim, AMK für Amikacin, LEVO für Levofloxacin und SXT für Trimethoprim-Sulfamethoxazol.
  2. 200 μL sterile Muller Hinton Brühe in Vertiefung Nummer 1 und Vertiefung Nummer 12 in jeder verwendeten Reihe pipetten. Bohrfach Nummer 12 wird als Negativkontrollbrunnen dienen.
  3. 100 μL sterile Muller Hinton Brühe in die Vertiefungen 2 bis 11 in jeder verwendeten Reihe pipetten.
  4. Berechnen Sie das Volumen jedes zuzugesetzten Arzneimittels mit der FormelC1V1 =C2V2. Somit ist V1 = (C2 x 4 x V2) / C1. V2 ist das Endvolumen in den Bohrungen, das 200 μL beträgt, C1 ist die Konzentration der Stammlösung undC2 ist die Anfangskonzentration, die wir in der ersten Bohrung haben müssen.
    HINWEIS: Hier verwenden wir Folgendes:
    Cefotaxim:C1 = 105 μg/ml, wobei wir es auf 104 μg/ml verdünnen,C2 = 256 μg/ml; somitV1 = 20,48 μL
    Amikacin: C1 = 103 μg/ml,C2 = 64 μg/ml; somitV1 = 51,2 μL
    Levofloxacin: C1 = 5 x 103 μg/ml, wobei wir es auf 5 x 102 μg/ml verdünnen,C2 = 16 μg/ml; somitV1 = 25,6 μL
    Trimethoprim-Sulfamethoxazol:C1 = 48 x 103 μg/ml,C2 = 4096 μg/ml; somitV1 = 68,26 μL
  5. Pipetten Sie das erforderliche Volumen für jedes Medikament in der ersten Vertiefung der entsprechenden Reihe, nachdem Sie das gleiche Volumen aus der 200 μL-Brühe entfernt haben, um nach der Zugabe des Arzneimittels ein Gesamtvolumen von 200 μL zu erhalten.
  6. Seriell verdünnen, indem 100 μL aus Bohrung 1 in Vertiefung 2 und so weiter entfernt werden, bis Bohrung 10 erreicht wird, wo die aus Vertiefung 10 entfernten 100 μL verworfen werden. Beachten Sie, dass Gut 11 als Positivkontrollbrunnen dient.
  7. Pipette 100 μL von 106 vorbereiteten bakteriellen Inokum in jede Vertiefung in jeder verwendeten Reihe mit Ausnahme von Bohrstätte Nummer 12, die als Negativkontrolle dient.
  8. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.

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Representative Results

Abbildung 2A stellt die Ergebnisse dar, die durch die Kombination von Cefotaxim und Amikacin mit spezifischen Konzentrationen von Levofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol erzielt werden. Wir können im linken Teil der Abbildung die vier Platten sehen, die schematisch mit den Konzentrationen der Medikamente im rechten Teil der Abbildung dargestellt sind. Die Pfeile stellen die Vertiefungen auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum dar. Die farbigen Brunnen sind die Brunnen, die Wachstum enthalten. Wir stellen fest, dass die vierte Platte kein Wachstum im Quadranten enthält, der die Kombination enthält. Dies liegt daran, dass wir in dieser Platte das MIC von Levofloxacin haben, das das Wachstum hemmt. In dieser Abbildung können wir sehen, dass das MIC des Cefotaxims in der Vertiefung A8 erhalten wird, was 32 μg / ml entspricht. Das MIC von Amikacin wird in der Vertiefung E1 erhalten, die 16 μg/ml entspricht. Ein Hemmwirkung ist in der Reihe zu sehen, die 1/2 MIC von Amikacin (Reihe D) zusätzlich zu mehreren SubMICs von Cefotaxim und Levofloxacin zusätzlich zu 1/8 MIC von Trimethoprim-Sulfamethoxazol enthält. Diese Hemmung des Bakterienwachstums in Vertiefungen, die SubMIC-Konzentrationen enthalten, könnte eine Form des Synergismus zwischen diesen Konzentrationen der vier Medikamente sein.

Abbildung 2B stellt die Ergebnisse dar, die durch die Kombination von Cefotaxim und Amikacin mit spezifischen Konzentrationen von Levofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol erzielt wurden. Wir können im linken Teil der Abbildung die vier Platten sehen, die schematisch mit den Konzentrationen der Medikamente im rechten Teil der Abbildung dargestellt sind. Die Pfeile stellen die Vertiefungen auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum dar. Die farbigen Brunnen sind die Brunnen, die Wachstum enthalten. Folgen Sie der gleichen Interpretation für die vierte Platte. In dem durch diese Abbildung dargestellten Panel können wir sehen, dass das Hemmungsmuster des Bakterienwachstums auch in Reihe D auftrat, wo die Vertiefungen SubMICs von Cefotaxim und Levofloxacin, 1/2 MIC von Amikacin und 1/4 MIC von Trimethoprim-Sulfamethoxazol enthalten.

Abbildung 2C stellt die Ergebnisse dar, die durch die Kombination von Cefotaxim und Amikacin mit spezifischen Konzentrationen von Levofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol erzielt wurden. Wir können im linken Teil der Abbildung die vier Platten sehen, die schematisch mit den Konzentrationen der Medikamente im rechten Teil der Abbildung dargestellt sind. Die Pfeile stellen die Vertiefungen auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum dar. Die farbigen Brunnen sind die Brunnen, die Wachstum enthalten. Folgen Sie der gleichen Interpretation für die vierte Platte. Was das Hemmungsmuster in diesem Panel betrifft, können wir sehen, dass in den Reihen C und D kein Wachstum zu sehen ist. Dies bedeutet, dass in den Vertiefungen mehrere SubMICs von Cefotaxim und Levofloxazin zusätzlich zu 1/2 MIC von Trimethoprim-Sulfamethoxazol und 1/4 MIC und 1/2 MIC von Amikacin enthalten sind.

Abbildung 2D stellt die Ergebnisse dar, die durch die Kombination von Cefotaxim und Amikacin mit spezifischen Konzentrationen von Levofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxazol erzielt werden. Wir können im linken Teil der Abbildung die vier Platten sehen, die schematisch mit den Konzentrationen der Medikamente im rechten Teil der Abbildung dargestellt sind. Die Pfeile stellen die Vertiefungen auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum dar. Folgen Sie der gleichen Interpretation für die vierte Platte. Wir können sehen, dass wir nur in Zeile A und Spalte 1 farbige Vertiefungen haben, die Wachstum bedeuten. Dies liegt daran, dass wir in diesem Panel das MIC von Trimethoprim-Sulfamethoxazol haben, das das Wachstum vollständig hemmt.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Q-Schachbrett-Setups und der Panels sowie eine Karte, wie die Medikamente hinzugefügt werden.

Figure 2
Abbildung 2: Die experimentellen Ergebnisse, die in Versuch 1 für bestimmte getestete Kombinationen erzielt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Quadruple Checkerboard-Methode ähnelt in ihrem Protokoll dem Schachbrett und dem dreidimensionalen Schachbrett. Es sollten jedoch bestimmte entscheidende Schritte berücksichtigt werden, um Fehler während des Experiments zu vermeiden.

Stellen Sie sicher, dass Sie das MIC jedes Arzneimittels gegen das getestete Isolat testen, bevor Sie das Protokoll starten, um zu wissen, welche Konzentrationen erforderlich sind, um die Verdünnungen für Medikament 1 und Medikament 2 zu starten, die in den Platten seriell verdünnt werden müssen. In Bezug auf Arzneimittel 3 und 4 sollte MIC auch dafür bekannt sein, die zu testende Konzentration zu berechnen (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC und MIC). Es gibt viele Methoden, um das MIC zu bestimmen, aber das Beste ist, es mit der Mikrodilutionstechnik zu bestimmen, da das Q-Checkerboard-Protokoll auch den Mikrodilutionsassay für die serielle Verdünnung verwendet.

Stellen Sie im ersten Schritt beim Abklopfen der Platten sicher, dass die Bank sauber ist und bedecken Sie die Platten mit sterilen Abdeckungen, um eine Kontamination zu vermeiden. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll mit vier 96-Well-Platten durchgeführt werden kann, die die vier Panels darstellen, wobei jede Platte in vier kleinere Quadranten unterteilt ist. Die Anzahl der Verdünnungen wird jedoch für das erste und zweite Medikament minimiert. Darüber hinaus kann man auch tiefe 384-Well-Platten verwenden, anstatt vier Platten zusammenzuklopfen. Es war jedoch nicht verfügbar, als wir die Experimente durchgeführt haben. Beachten Sie, dass Sie bei der Auswahl der zu verwendenden Platte die Kapazität jedes Bohrbrunnens überprüfen sollten, da das endgültige Volumen in der Vertiefung 250 μL beträgt.

Darüber hinaus hängt die Anzahl der Platten in jedem Panel und die Anzahl der Panels von der Anzahl der Verdünnungen ab, die für das dritte und vierte Medikament erforderlich sind. Zum Beispiel waren in diesem Experiment vier Verdünnungen des dritten Arzneimittels und vier Verdünnungen des vierten Arzneimittels erforderlich (1/8 MIC, 1/4 MIC, 1/2 MIC und MIC); So hatten wir vier Platten in jedem Panel und vier Panels.

Die Verdünnung des ersten Arzneimittels erfolgt in den Platten der Platten entsprechend den Säulen. Die Verdünnung des zweiten Arzneimittels erfolgt jedoch in separaten Platten entsprechend den Reihen. Das dritte und vierte Arzneimittel werden nicht seriell verdünnt. Jede verwendete Konzentration wird jedoch in einem separaten Röhrchen hergestellt und jeder Vertiefung in einem bestimmten Volumen zugesetzt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Vertiefungen, die die vier Medikamente enthalten, nur im Quadranten zwischen den Zeilen G und B und den Spalten 2 und 12 vorhanden sind. Das Schachbrett und die dreidimensionalen Schachbrettprotokolle wurden in diesem Manuskript nicht gefilmt oder geschrieben, da es sich um bekannte Protokolle handelt und der Zweck dieses Manuskripts darin besteht, über das Q-Schachbrettprotokoll zu sprechen. In der Schachbretttechnik enthält Zeile A nur Medikament 1; so wird das MIC von Medikament 1 angezeigt. Spalte 1 enthält nur Medikament 2; so wird das MIC von Medikament 2 angezeigt.

Dieses Konzept wird im Q-Checkerboard-Protokoll beibehalten, woBEI MIC von Medikament 1 noch in Zeile A und MIC von Medikament 2 in Spalte 1 angezeigt wird. Darüber hinaus präsentieren die beiden hinzugefügten Medikamente ihre MIC im Experiment. Medikament 3 hat die P4-Platte in jedem Panel, wo das MIC von Medikament 3 zu allen Vertiefungen hinzugefügt wird, so dass wir kein Wachstum in dieser Platte beobachten sollten. In ähnlicher Weise hat Medikament 4 ein A4-Panel, bei dem das MIC von Medikament 4 zu allen Vertiefungen in allen Platten in Panel 4 hinzugefügt wird, so dass in diesem Panel kein Wachstum beobachtet werden sollte.

Das Wachstum in den Platten wird basierend auf der Trübung in den Bohrbrunnen aufgezeichnet, wo die trüben Brunnen als wachsend gelten. Zusätzlich zur Trübung werden 50 μL Iodotetrazolium zugegeben und einige Minuten belassen. Eine Veränderung der Farbe zu Rosa bedeutet, dass es Wachstum gibt.

Diese Methode hat bestimmte Einschränkungen. Es erfordert harte Arbeit und Konzentration. Pipettierfehler können auftreten, da diese Technik hauptsächlich auf Pipettieren basiert. Die FIC-Berechnungen gelten in diesem Fall als Einschränkung, da wir es mit vier Werten zu tun haben, nicht mit zwei oder drei. Das Hinzufügen eines Wertes erhöht den Wert des FIC im Bohrbrunnen; Daher müssen die Werte der FIC, die Synergie, Gleichgültigkeit und Antagonismus bestimmen, überdacht werden.

FIC-Werte können sich zwischen mehreren Referenzen in Bezug auf die Standards ändern, durch die Synergie, Antagonismus und Gleichgültigkeit definiert werden. Bestimmte Referenzen besagen, dass ein FIC von 0,5 und weniger als Synergismus13betrachtet wird, während andere angeben, dass ein FIC kleiner als 0,8 als Synergismus16betrachtet wird. Eine andere Referenz besagt, dass ein FIC kleiner als 1 als Synergie17betrachtet wird. Aufgrund der Instabilität und des Konflikts bei der Definition eines einheitlichen Standard-FIC des Synergismus betrachteten wir 1 als unsere Referenz.

Der endgültige FIC wird berechnet, indem die FIC-Werte jeder Platte (9 FICs) addiert und durch die Anzahl der Platten dividiert werden, die 9 ist. Es ist wichtig zu beachten, dass Panel 4 in den Ergebnissen nicht berücksichtigt wird, da es das MIC des vierten Arzneimittels enthält, so dass die Hemmung die Arbeit eines einzelnen Arzneimittels ist. Darüber hinaus wird Platte 4 in jedem Panel auch nicht berücksichtigt, da sie das MIC von Medikament 3 enthält, wobei die Hemmung in dieser Platte der Akt von Medikament 3 allein ist. So landen wir bei 9 Platten (16 - (4 + 3)).

Für jede Platte werden die FICs für die Vertiefungen auf der Growth/no Growth-Schnittstelle nach folgender Formel berechnet: (MIC von Medikament 1 in Kombination / MIC von Medikament 1 allein) + (MIC von Medikament 2 in Kombination / MIC von Medikament 2 allein) + (MIC von Medikament 3 in Kombination / MIC von Medikament 3 allein) + (MIC von Medikament 4 in Kombination / MIC von Medikament 4 allein). Dann wird die erhaltene Zahl durch 4 geteilt. Diese Formel wird für jede Vertiefung auf der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum in derselben Platte durchgeführt. Dann werden alle FICs derselben Platte summiert, um den FIC dieser Platte zu erhalten. Schließlich, wie bereits erwähnt, werden die 9 endgültigen FICs jeder Platte addiert und durch 9 geteilt, um die endgültige FIC zu erhalten, die interpretiert wird.

Ein FIC kleiner als 1 gilt als synergistisch, wenn er einen gewissen Grad an Synergie aufwies: Er ist entweder leicht synergistisch (nahe an eins) oder synergistischer (wenn er sich in Richtung 0,5 und weniger bewegt). Diese Berechnung und Interpretation erfolgt einfach mit einer von uns entwickelten FIC-Vorlage. Wir geben einfach die Konzentrationen ein, wählen die Bohrungen an der Schnittstelle Wachstum/kein Wachstum aus, um die FICs zu berechnen, und wir erhalten den endgültigen FIC, der gemäß den genannten Kriterien interpretiert wird.

Diese Methode ermöglicht das Testen aller möglichen Kombinationen, die mit vier Medikamenten in einem Experiment durchgeführt werden können, das an einem Tag durchgeführt werden kann. Die Ergebnisse werden am nächsten Tag erhalten. Während zum Zeitpunkt des Kill-Curve-Assays mehr Zeit, Arbeitsmaterialien und Labormitarbeiter benötigt werden, um die gleiche Anzahl von Kombinationen zu testen, da jeder Satz von Kombinationen allein in einem einzigen Röhrchen oder Becher getestet wird, was es zeitaufwendig macht. Diese Methode kann nicht nur verwendet werden, um antibakterielle Arzneimittelkombinationen zu testen, sondern auch um alle Arten von Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten zu testen und muss in Kombination getestet werden. Es kann auch verwendet werden, um eine Kombination von Medikamenten und Pflanzenextrakten oder sogar eine Kombination von nur Pflanzenextrakten zu testen. Der Punkt ist, dass diese Methode verwendet werden kann, um nicht nur bestimmte Medikamente zu testen, sondern alles, was kombiniert werden kann.

Mehrere Einschränkungen begleiten diese Methode. Pipettierfähigkeiten sind bei der Durchführung dieses Assays sehr wichtig, und jeder Fehler, der beim Pipettieren und seriellen Verdünnen auftreten kann, kann sich negativ auf die Ergebnisse auswirken und zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen. Daher werden alle technologischen Fortschritte in Bezug auf Pipettiermaschinen und Roboter eine große Hilfe bei der Durchführung dieses Assays sein. Diese Methode erfordert viele Berechnungen und Verdünnungen, so dass jeder einzelne Fehler das Ergebnis der Ergebnisse verändern kann. Diese Technik liefert nur Einblicke in den Hemmwirkungseffekt und nicht in den Tötungseffekt. Diese Technik untersucht die Hemmung zu einem einzigen Zeitpunkt und nicht im Laufe der Zeit.

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Disclosures

nichts.

Acknowledgments

nichts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000 µL tips Citotest 4330000402
200 µL tips Citotest 4330-0013-17
50 mL centrifuge tube corning 430828 For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube Falcon 352058 For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes JRZ Plastilab As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates corning 3596 For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France 10177403 Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime) PHARCO Pharmaceuticals 24750/2006 Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar BIO-RAD 64169508 For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) HIKMA Pharmaceuticals 2BXMIA56N-AEF Drug 2
Muller-Hinton Broth BIO-RAD 69444 For making bacterial media
Multichannel Pipette Thermo Scientific GJ54761 For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes Thermo Scientific OH19855 HH40868 For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) sanofi aventis 221937/2009 Drug 3

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Biologie Ausgabe 173 Antibiotikakombination Schachbrett Vier Wechselwirkungen mit Medikamenten
Vierfach-Schachbrett: Eine Modifikation des dreidimensionalen Schachbretts zur Untersuchung von Arzneimittelkombinationen
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Isber, C., Stockman, D. L., Daoud, Z. Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations. J. Vis. Exp. (173), e62311, doi:10.3791/62311 (2021).

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