Summary

遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)

Published: March 12, 2021
doi:

Summary

この研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウス褐色脂肪細胞を単離する新しい方法について説明します。

Abstract

褐色脂肪組織(BAT)は哺乳類の非震え熱発生に関与しており、褐色脂肪細胞(BA)はBATの機能単位です。BAは多房性脂肪滴と豊富なミトコンドリアの両方を含み、脱共役タンパク質1(UCP1)を発現します。BAは、その起源に基づいて、胚由来の古典的BA(cBA)と白色脂肪細胞由来のBAの2つのサブタイプに分類されます。BAは密度が比較的低いため、従来の遠心分離法ではBATから分離できません。本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウスからBAを単離する新しい方法を開発しました。このプロトコルでは、成体マウスの肩甲骨間BATをコラゲナーゼおよびディスパーゼ溶液で消化し、解離したBAを6%ヨージキサノール溶液で濃縮した。次に、単離したBAをTrizol試薬で溶解し、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に単離しました。RNA単離後、ライセートの有機相をタンパク質抽出に使用した。私たちのデータは、6%ヨージキサノール溶液がフォローアップ遺伝子およびタンパク質発現研究を妨げることなくBAを効率的に濃縮することを示しました。血小板由来成長因子(PDGF)は、間葉系細胞の増殖および増殖を調節する成長因子である。褐色脂肪組織と比較して、単離されたBAは Pdgfaの発現が有意に高かった。要約すると、この新しい方法は、褐色脂肪細胞の生物学を単一の細胞型レベルで研究するためのプラットフォームを提供します。

Introduction

マウスとヒトの両方に、白色脂肪組織(WAT)と褐色脂肪組織(BAT)の2種類の脂肪組織があります1。WATは白色脂肪細胞に中性脂肪の形でエネルギーを蓄え、BATの褐色脂肪細胞(BA)は化学エネルギーを熱2として放散します。BAは、その発生起源に基づいて、胚発生中に形成される古典的なBA(cBA)と、ストレス条件下で白色脂肪細胞から変換された白色脂肪細胞由来のBA(ベージュ/ブライト細胞)にさらに分類されます3。BAは多房性であり、熱発生タンパク質脱共役タンパク質1(UCP1)4を発現します。肩甲骨間BAT(iBAT)デポーは、小型哺乳類の主要なcBAデポの1つです5が、ベージュ色の細胞はWAT6内に分散しています。

エネルギーを散逸させる性質上、BAは肥満を減らすための治療標的として多くの注目を集めています7。肥満の治療を目的としてBAを利用するためには、BAの機能、生存、および動員を制御する分子メカニズムを理解することが不可欠です。BATおよびWATを含む脂肪組織は不均一である。脂肪細胞を除いて、脂肪組織には内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージなど、他の多くの細胞タイプが含まれています8。UCP1::Creライン9など、マウスBAの候補遺伝子を特異的に枯渇させる遺伝的ツールが利用可能であるが、BATまたはWATからBAを精製する技術は限られており、単一細胞レベルでBAを研究することは困難である。さらに、純粋なBAを取得しないと、BAと非BAの関係が明確に描写されません。例えば、血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)は、未分化間葉系細胞のマーカーとして使用されており、BATの内皮細胞や間質細胞で発現しています。低温ストレスBATでは、PDGFRα陽性前駆細胞が新しいBA10を生じさせる。PDGFRαは、間葉系細胞の成長および増殖を調節する成長因子であるリガンドPDGFによって活性化される11;しかし、BAがPDGFを分泌することによってPDGFRα陽性前駆細胞の挙動に影響を与えるかどうかは不明である。

最近、蛍光活性化セルソーティング(FACS)12に基づくBAs分離プロトコルが公開されました。このプロトコルでは、3%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を使用してBAを非BAから分離し、濃縮BAをFACSでさらに精製しました。このプロトコルの適用は、機器とFACSの両方の操作経験に依存するFACSプロセスの要件によって制限されます。本研究では、BATからBAを分離するための新しいプロトコルが開発されました。このプロトコルによって単離されたBAは、遺伝子およびタンパク質発現研究に直接使用できます。さらに、この研究のデータは、BAが主要なPDGFリソースであることを示唆しています。

Protocol

すべてのマウスは病原体のない状態で維持され、すべての手順はフリーメーソン医学研究施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。UCP1::Cre9 およびRosa 26tdTomatoes マウス系統13 が以前に報告された。すべてのマウスを12時間の明暗サイクルで室温に保ちました。 1.溶液と褐色脂肪組織(BAT)の準備 消化液?…

Representative Results

褐色脂肪細胞単離のための肩甲間BATの調製褐色脂肪細胞(BA)の単離プロセスを 図1Aに示します。BATおよび消化/分離溶液の調製から単離されたBAの取得までのプロセス全体には、約4時間かかります。 成体マウスでは、肩甲骨間領域に豊富なBATが存在する。この肩甲骨間BAT(iBAT)は、筋肉層とWATで覆われています(図1B…

Discussion

本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためのBAを単離する新しい方法を開発しました。

公開されているBA分離プロトコルでは、3%BSA溶液を使用してBA12を濃縮しました。それにもかかわらず、この公開されたプロトコルによって達成された濃縮BAは、タンパク質発現分析に直接使用することはできませんでした。これは、BAs溶液に存在する濃縮BS…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Z. Linは、国立衛生研究所HL138454-01とフリーメーソン医学研究所の資金によって支援されました。

Materials

Antibodies
Antigen Company Catalog
PPARγ LSBio Ls-C368478
PDGFRa Santa Cruz sc-398206
UCP1 R&D system IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II Thermo Fisher Scientific 17101015
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)  Goldbio A-421-10
Calcium chloride Bio Basic CT1330
Chloroform IBI Scientific IB05040
Dispase II, protease Sigma-Aldrich D5693
EDTA Bio Basic EB0107
Ethanol IBI Scientific IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix LifeSct LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate Boston BioProducts P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix ABM G454
OptiPrep (Iodixanol) Cosmo Bio USA AXS-1114542
PBS (10x) Caisson Labs PBL07
PBS (1x) Caisson Labs PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
Potassium Chloride Boston BioProducts P-1435
SimplyBlue safe Stain Invitrogen LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 75746
Trizol reagent Life technoologies 15596018
Primers
Gene name (Species)  Forward Reverse
Pdgfra (Mouse) CTCAGCTGTCTCCTCACAgG CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse) TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse) TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1 ACTGCCACACCTCCAGTCATT CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name Company Application
Keyence BZ-X700 Keyence Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer VWR Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System Applied Biosystem Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system LI-COR Western blot immaging

References

  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

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Cite This Article
Negron, S. G., Xu, B., Lin, Z. Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis. J. Vis. Exp. (169), e62332, doi:10.3791/62332 (2021).

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