Summary

בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

Published: March 12, 2021
doi:

Summary

מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

Abstract

רקמת שומן חום (BAT) אחראית לתרמוגנזה שאינה רועדת ביונקים, ואדיפוציטים חומים (BAs) הם היחידות הפונקציונליות של BAT. BAs מכילים גם טיפות ליפידים מולטילוקולריות וגם מיטוכונדריה בשפע, והם מבטאים חלבון 1 (UCP1) שאינו מתמזג. BAs מסווגים לשני תתי-סוגים בהתבסס על מקורם: BAs קלאסיים שמקורם בעוברים (cBAs) ו-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים. בשל צפיפותם הנמוכה יחסית, לא ניתן לבודד BAs מ- BAT בשיטת צנטריפוגה מסורתית. במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs מעכברים לצורך ניתוח ביטוי גנים וחלבונים. בפרוטוקול זה, BAT בין-סקפולרי מעכברים בוגרים עוכל בתמיסת קולגן ותמיסת Dispase, וה-BAs המנותקים הועשרו בתמיסת יודיקסנול של 6%. לאחר מכן, BAs מבודדים הוכנסו לריאגנט Trizol לבידוד סימולטני של RNA, DNA וחלבון. לאחר בידוד RNA, השלב האורגני של הליזאט שימש למיצוי חלבונים. הנתונים שלנו הראו שתמיסת יודיקסנול 6% העשירה ביעילות BAs מבלי להפריע למחקרי מעקב אחר גנים וביטוי חלבונים. גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF) הוא גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים. בהשוואה לרקמת השומן החומה, ל-BAs המבודדים היה ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי של Pdgfa. לסיכום, שיטה חדשה זו מספקת פלטפורמה לחקר הביולוגיה של אדיפוציטים חומים ברמה של תא יחיד.

Introduction

גם לעכברים וגם לבני אדם יש שני סוגים של רקמות שומן: רקמת שומן לבנה (WAT) ורקמת שומן חומה (BAT)1. WAT מאחסן אנרגיה בצורה של טריגליצרידים באדיפוציטים לבנים, והאדיפוציטים החומים (BAs) של BAT מפזרים אנרגיה כימית כחום2. בהתבסס על מקורם ההתפתחותי, BAs מסווגים עוד יותר ל-BAs קלאסיים (cBAs) שנוצרו במהלך התפתחות העובר ול-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים (תאי בז’/בריט, שהומרו מאדיפוציטים לבנים בתנאי עקה)3. BAs הם רב-לוקולריים ומבטאים את החלבון התרמוגני שאינו מתחבר לחלבון 1 (UCP1)4. מחסן BAT אינטרסקפולרי (iBAT) הוא אחד ממחסני ה-cBAs העיקריים ביונקים קטנים5, בעוד שתאי בז’ מפוזרים בתוך WAT6.

בשל אופי פיזור האנרגיה שלהם, BAs קיבלו תשומת לב רבה כיעד טיפולי להפחתת השמנת יתר7. כדי לנצל את BAs לצורך טיפול בהשמנת יתר, חיוני להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים בתפקוד, בהישרדות ובגיוס של BAs. רקמות שומן כולל BAT ו- WAT הן הטרוגניות. מלבד אדיפוציטים, רקמות השומן מכילות סוגי תאים רבים אחרים, כגון תאי אנדותל, תאי גזע מזנכימליים ומקרופאגים8. למרות שקיימים כלים גנטיים לדלדול ספציפי של גנים מועמדים בעכברים BAs, כגון UCP1::Cre line9, טכניקות לטיהור BAs מ-BAT או WAT מוגבלות, מה שמקשה על חקר BAs ברמה של תא יחיד. בנוסף, ללא קבלת BAs טהורים, היחסים בין BAs לבין אלה שאינם BAs לא יהיו מוגדרים בבירור. לדוגמה, קולטן גורם גדילה אלפא (PDGFRα) שמקורו בטסיות משמש כסמן לתאים מזנכימליים לא מובחנים, והוא מתבטא בתאי האנדותל והאינטרסטיציאליים של BAT. ב-BAT בלחץ קר, תאי אב חיוביים PDGFRα מולידים BAs10 חדש. PDGFRα מופעל על ידי הליגנד PDGF שלו, גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים11; עם זאת, לא ברור אם BAs משפיעים על ההתנהגות של תאי אב חיוביים PDGFRα על ידי הפרשת PDGF.

לאחרונה פורסם פרוטוקול בידוד BAs, המבוסס על מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)12. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) כדי להפריד בין BAs ללא BAs, וה-BAs המועשרים טוהרו עוד יותר על ידי FACS. היישום של פרוטוקול זה מוגבל על-ידי הדרישה של תהליך FACS, המסתמך הן על ציוד והן על חוויות פעולה של FACS. במחקר זה פותח פרוטוקול חדש לבידוד BAs מ-BAT. ה-BAs המבודדים על ידי פרוטוקול זה יכולים לשמש ישירות למחקרי ביטוי גנים וחלבונים. יתר על כן, נתונים ממחקר זה מצביעים על כך ש- BAs הם משאב PDGF מרכזי.

Protocol

כל העכברים הוחזקו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). UCP1::Cre9 ורוזה 26tdTomato עכברים קווים13 דווחו בעבר. כל העכברים הוחזקו בטמפרטורת החדר עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. 1. הכנת התמיסה ורקמת השומן ה…

Representative Results

הכנת BAT אינטראקפולרי לבידוד אדיפוציטים חומיםתהליך הבידוד של האדיפוציטים החומים (BAs) מתואר באיור 1A. התהליך כולו, החל מהכנת BAT ופתרונות עיכול/הפרדה ועד לקבלת BAs מבודדים ייקח כ-4 שעות. בעכברים בוגרים, BAT בשפע קיים באזור הבין-שבדי. ה-BAT הבין-סקפולרי הזה (iBA…

Discussion

במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

בפרוטוקול בידוד BAs שפורסם, נעשה שימוש בפתרון BSA של 3% להעשרת BAs12. עם זאת, לא ניתן היה להשתמש ישירות ב-BAs המועשר שהושגו על ידי פרוטוקול זה שפורסם לצורך ניתוח ביטוי חלבונים. הסיבה לכך היא שה-BSA המרוכז הקיים ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Z. Lin נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות HL138454-01 וקרנות מכון המחקר הרפואי הבונים החופשיים.

Materials

Antibodies
Antigen Company Catalog
PPARγ LSBio Ls-C368478
PDGFRa Santa Cruz sc-398206
UCP1 R&D system IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II Thermo Fisher Scientific 17101015
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)  Goldbio A-421-10
Calcium chloride Bio Basic CT1330
Chloroform IBI Scientific IB05040
Dispase II, protease Sigma-Aldrich D5693
EDTA Bio Basic EB0107
Ethanol IBI Scientific IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix LifeSct LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate Boston BioProducts P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix ABM G454
OptiPrep (Iodixanol) Cosmo Bio USA AXS-1114542
PBS (10x) Caisson Labs PBL07
PBS (1x) Caisson Labs PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
Potassium Chloride Boston BioProducts P-1435
SimplyBlue safe Stain Invitrogen LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 75746
Trizol reagent Life technoologies 15596018
Primers
Gene name (Species)  Forward Reverse
Pdgfra (Mouse) CTCAGCTGTCTCCTCACAgG CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse) TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse) TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1 ACTGCCACACCTCCAGTCATT CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name Company Application
Keyence BZ-X700 Keyence Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer VWR Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System Applied Biosystem Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system LI-COR Western blot immaging

References

  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

Play Video

Cite This Article
Negron, S. G., Xu, B., Lin, Z. Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis. J. Vis. Exp. (169), e62332, doi:10.3791/62332 (2021).

View Video