Здесь мы представляем протокол для создания трехмерной упрощенной и недифференцированной модели кожи с использованием микрообрабатываемой микрофлюидной платформы. Параллельный поточный подход позволяет наживать in situ кожный компартмент для посева эпителиальных клеток сверху, управляемых шприцевыми насосами.
Эта работа представляет собой новую, экономически эффективную и надежную микрофлюидную платформу с потенциалом для создания сложных многослойных тканей. В качестве доказательства концепции была смоделирована упрощенная и недифференцированная кожа человека, содержащая дермальный (стромальный) и эпидермальный (эпителиальный) компартмент. Для достижения этой цели было разработано универсальное и надежное устройство на основе винила, разделенное на две камеры, преодолевающее некоторые недостатки, присутствующие в микрофлюидных устройствах на основе полидиметилсилоксана (PDMS) для биомедицинских применений, таких как использование дорогостоящего и специализированного оборудования или поглощение небольших гидрофобных молекул и белков. Кроме того, был разработан новый метод, основанный на параллельном потоке, позволяющий осуществлять осаждение in situ как кожного, так и эпидермального компартментов. Конструкция кожи состоит из фибриновой матрицы, содержащей первичные фибробласты человека и монослой из увековеченных кератиноцитов, посеянных сверху, который впоследствии поддерживается в условиях динамической культивации. Эта новая микрофлюидная платформа открывает возможность моделировать кожные заболевания человека и экстраполировать метод для генерации других сложных тканей.
В последнее время были достигнуты успехи в разработке и производстве моделей кожи человека in vitro для анализа токсичности косметических и фармацевтических продуктов1. Исследователи в фармацевтической и коже промышленности используют животных, мышей которых мышей являются наиболее распространенными, для тестирования своих продуктов2,3,4,5. Однако тестирование продуктов на животных не всегда предсказывает реакцию у людей, что часто приводит к отказу лекарств или неблагоприятным последствиям у людей и, следовательно, к экономическим потерям5,6. Великобритания была первой страной, которая запретила использование животных для косметического тестирования в 1998 году. Позже, в 2013 году, ЕС запретил тестирование и апробацию косметики на животных (Регламент ЕС по косметике No 1223/2009)7.
Этот запрет также рассматривается другими странами, такими как «Закон о гуманистической косметике» в США8. В дополнение к этическим соображениям, анатомические различия между кожей животных и человека делают тестирование на животных трудоемким, дорогостоящим и часто неэффективным. Кроме того, ожидается, что к 2025 году объем мирового рынка токсикологических испытаний in vitro достигнет 26,98 млрд долларовСША9. По этим причинам существует необходимость в разработке новых методов и альтернатив для этих исследований in vitro, таких как биоинженерные модели кожи человека, которые позволяют тестировать безопасность и токсическое воздействие косметики и лекарств без использования животных.
Существует два различных вида коммерчески доступных, in vitro, моделей человеческой кожи. Первый тип состоит из стратифицированных эпидермальных эквивалентов, содержащих несколько слоев дифференцирующих кератиноцитов, которые высеиваются на разных материалах. Некоторые из них были одобрены Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) и одобрены (Европейским центром валидации альтернативных методов (ECVAM) для тестирования на коррозию и раздражение кожи, таких как EpiDerm или SkinEthic10,11,12. Второй тип представляют собой полнокожные эквиваленты со слоем дифференцированных кератиноцитов человека, посеянных на трехмерном (3D) каркасе, который содержит фибробласты, такие как T-Skin и EpiDerm-FT. Однако эти модели культивируются в статических условиях, что делает их неспособными точно представлять физиологические условия человека.
Недавний интерес был сосредоточен на создании in vitro 3D-моделей кожи в форматах клеточной культуры-вставки (CCI) с динамической перфузией13,14,15,16,17,18,19. Тем не менее, эти системы не могут рассматриваться stricto sensu как микрофлюидные «кожа на чипах» в соответствии с их классическим определением в этой области. Определение Ингбера для органов на чипе гласит, что орган должен быть помещен внутрь микрофлюидных каналов, что является условием, что только несколько устройств удовлетворяют20,21. Skin-on-chips до сих пор моделировали в основном простой эпителий в виде одноклеточных слоев и/или слоев кожных клеток, разделенных пористой мембраной22,23. Хотя были достигнуты некоторые успехи в моделировании кожи в микрофлюидных системах16,24,в настоящее время нет литературы, показывающей систему «орган на чипе», которая соответствует определению Ингбера, способная производить многослойную кожу in situ и включающая как эпителиальные, так и стромальные компоненты.
В этой работе представлена новая, экономичная, надежная микрофлюидная платформа на основе винила для приложений «кожа на чипе». Данная платформа была изготовлена путем микрообработки, что обеспечивает большую простоту в процессе изготовления, а также повышенную гибкость и универсальность в компоновке устройства, преодолевая некоторые ограничения PDMS25. Также был разработан способ введения упрощенной конструкции обшивки через параллельный поток, управляемый шприцевыми насосами. Параллельный поток позволяет двум жидкостям с очень разной вязкостью (в данном случае буферу и прегелю фибрина) перфузиться через канал без смешивания друг с другом. В качестве доказательства концепции в устройство была введена дермо-эпидермальная конструкция, содержащая фибробласты, встроенные в фибриновую матрицу, имитируя дерму, поверх которой был загружен монослой кератиноцитов для эмуляции недифференцированного эпидермиса. Высота кожного отсека может модулироваться путем изменения скорости потока. Главной новинкой этой работы, по сравнению с ранее описанными моделями22,26,27,28,29,является разработка 3D-конструкции внутри микрокамеры с помощью микрофлюидики. Хотя в этой статье представлена упрощенная недифференцированная кожа, долгосрочная цель состоит в том, чтобы создать и охарактеризовать полностью дифференцированную конструкцию кожи, чтобы продемонстрировать ее жизнеспособность и функциональность для целей лекарственного и косметического тестирования.
Мотивацией для разработки этого метода было желание моделировать кожные заболевания и изучать эффекты новых и инновационных методов лечения на высокопроизводительной платформе. На сегодняшний день эта лаборатория производит эти дермо-эпидермальные эквиваленты путем литья — вручну…
The authors have nothing to disclose.
Мы искренне благодарим д-ра Хавьера Родригеса, д-ра Марию Луизу Лопес, Карлоса Мателлана и Хуана Франсиско Родригеса за очень полезные предложения, обсуждения и/или предварительные данные. Мы также благодарим Серхио Фернандеса, Педро Эррероса и Лару Штольценбург за вклад в этот проект. Особая благодарность доктору Марте Гарсия за HFB и hKCs с маркировкой GFP. Наконец, мы отмечаем прекрасную техническую помощь Гильермо Вискаино и Анжелики Корраль. Эта работа была поддержана «Программой деятельности I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid», проект S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Эта работа была также поддержана “Программой превосходства”, проектом EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
Culture plates | Fisher | ||
DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
Glass slide | Thermo Scientific | ||
GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
Live/dead kit | Invitrogen | ||
PBS | Sigma Aldrich | ||
Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
Syringes | Terumo | 5 mL | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |