Generierung eines vereinfachten dreidimensionalen Skin-on-a-Chip-Modells in einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein dreidimensionales vereinfachtes und undifferenziertes Hautmodell unter Verwendung einer mikrobearbeiteten mikrofluidischen Plattform zu generieren. Ein paralleler Strömungsansatz ermöglicht die In-situ-Ablagerung eines Hautkompartiments für die Aussaat von Epithelzellen auf der Oberseite, die alle von Spritzenpumpen gesteuert werden.
Abstract
Diese Arbeit stellt eine neue, kostengünstige und zuverlässige mikrofluidische Plattform mit dem Potenzial dar, komplexe mehrschichtige Gewebe zu erzeugen. Als Proof of Concept wurde eine vereinfachte und undifferenzierte menschliche Haut modelliert, die ein dermales (stromales) und ein epidermales (epitheliales) Kompartiment enthält. Um dies zu erreichen, wurde ein vielseitiges und robustes, vinylbasiertes Gerät entwickelt, das in zwei Kammern unterteilt ist und einige der Nachteile mikrofluidischer Geräte auf Basis von Polydimethylsiloxan (PDMS) für biomedizinische Anwendungen überwindet, wie z.B. die Verwendung teurer und spezialisierter Geräte oder die Absorption kleiner, hydrophober Moleküle und Proteine. Darüber hinaus wurde eine neue Methode entwickelt, die auf parallelem Fluss basiert und die In-situ-Ablagerung sowohl des dermalen als auch des epidermalen Kompartiments ermöglicht. Das Hautkonstrukt besteht aus einer Fibrinmatrix, die menschliche primäre Fibroblasten enthält, und einer Monoschicht aus immortalisierten Keratinozyten, die oben ausgesät sind und anschließend unter dynamischen Kulturbedingungen aufrechterhalten werden. Diese neue mikrofluidische Plattform eröffnet die Möglichkeit, menschliche Hautkrankheiten zu modellieren und die Methode zu extrapolieren, um andere komplexe Gewebe zu erzeugen.
Introduction
In jüngster Zeit wurden Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion von In-vitro-Modellen für die menschliche Haut zur Analyse der Toxizität kosmetischer und pharmazeutischer Produkteerzielt 1. Forscher in der Pharma- und Hautpflegeindustrie haben Tiere verwendet, wobei Mäuse am häufigsten vorkommen, um ihre Produkte zu testen2,3,4,5. Das Testen von Produkten an Tieren ist jedoch nicht immer prädiktiv für das Ansprechen beim Menschen, was häufig zu Arzneimittelversagen oder nebenwirkungen beim Menschen und folglich zu wirtschaftlichen Verlusten führt5,6. Das Vereinigte Königreich war das erste Land, das 1998 die Verwendung von Tieren für kosmetische Tests verbot. Später, im Jahr 2013, verbot die EU die Prüfung und Approbation von Kosmetika an Tieren (EU-Kosmetikverordnung Nr. 1223/2009)7.
Dieses Verbot wird auch von anderen Ländern in Betracht gezogen, wie z.B. im “Humane Cosmetics Act” in den USA8. Neben ethischen Bedenken machen die anatomischen Unterschiede zwischen Tier- und Menschenhaut Tierversuche zeitaufwendig, teuer und oft unwirksam. Darüber hinaus wird erwartet, dass der globale Markt für In-vitro-Toxikologie-Tests bis 2025 26,98 Milliarden US-Dollar erreichenwird 9. Aus diesen Gründen besteht die Notwendigkeit, neue Methoden und Alternativen für diese In-vitro-Studien zu entwickeln, wie z. B. biotechnologisch hergestellte menschliche Hautmodelle, die es ermöglichen, die Sicherheit und toxische Wirkung von Kosmetika und Arzneimitteln ohne den Einsatz von Tieren zu testen.
Es gibt zwei verschiedene Arten von kommerziell erhältlichen, in vitro, menschlichen Hautmodellen. Der erste Typ besteht aus geschichteten epidermalen Äquivalenten, die mehrere Schichten differenzierender Keratinozyten enthalten, die auf verschiedenen Materialien ausgesät werden. Einige von ihnen wurden von der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) genehmigt und vom Europäischen Zentrum zur Validierung alternativer Methoden (ECVAM) für Hautkorrosions- und Reizungstests validiert, wie EpiDerm oder SkinEthic10,11,12. Der zweite Typ sind Vollhautäquivalente mit einer Schicht differenzierender menschlicher Keratinozyten, die auf einem dreidimensionalen (3D) Gerüst ausgesät sind, das Fibroblasten wie T-Skin und EpiDerm-FT enthält. Diese Modelle werden jedoch unter statischen Bedingungen kultiviert, was sie nicht in der Lage macht, die physiologischen Bedingungen des Menschen genau darzustellen.
Das jüngste Interesse konzentrierte sich auf die Generierungvon In-vitro-3D-Hautmodellen in Zellkultur-Insert-Formaten (CCI) mit dynamischer Perfusion13,14,15,16,17,18,19. Diese Systeme können jedoch nicht streng sensu als mikrofluidische Skin-on-Chips im Sinne ihrer klassischen Definition im Feld betrachtet werden. Ingbers Definition für Organe auf einem Chip besagt, dass das Organ innerhalb der mikrofluidischen Kanäle platziert werden muss, was eine Bedingung ist, dass nur wenige Geräte20,21erfüllen. Skin-on-Chips haben bisher meist einfache Epithelien als Einzelzellschichten und/oder dermale Zellschichten modelliert, die durch eine poröse Membran getrennt sind22,23. Obwohl es einige Fortschritte bei der Modellierung der Haut in mikrofluidischen Systemen gegeben hat16,24, gibt es derzeit keine Literatur, die ein Organ-on-a-Chip-System zeigt, das Ingbers Definition entspricht, das in der Lage ist, eine mehrschichtige Haut in situ zu erzeugen und sowohl epitheliale als auch stromale Komponenten zu enthalten.
In dieser Arbeit wird eine neue, kostengünstige, robuste, vinylbasierte mikrofluidische Plattform für Skin-on-a-Chip-Anwendungen vorgestellt. Diese Plattform wurde durch Mikrobearbeitung hergestellt, die mehr Einfachheit im Herstellungsprozess sowie erhöhte Flexibilität und Vielseitigkeit im Layout des Geräts bietet und einige der Einschränkungen von PDMS25 überwindet. Es wurde auch eine Möglichkeit entwickelt, ein vereinfachtes Hautkonstrukt durch einen parallelen, mit Spritzenpumpen gesteuerten Durchfluss einzuführen. Durch den parallelen Fluss können zwei Flüssigkeiten mit sehr unterschiedlichen Viskositäten (in diesem Fall ein Puffer und ein Fibrin-Pre-Gel) durch einen Kanal durchblutet werden, ohne sich miteinander zu vermischen. Als Proof of Concept wurde ein dermo-epidermales Konstrukt mit Fibroblasten, die in eine Fibrinmatrix eingebettet sind, die die Dermis nachahmt, in das Gerät eingeführt, auf dem eine Monoschicht von Keratinozyten geladen wurde, um die undifferenzierte Epidermis zu emulieren. Die Höhe des Hautfachs kann durch Modifikation der Durchflussraten moduliert werden. Die Hauptneuheit dieser Arbeit ist im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Modellen22,26,27,28,29, die Entwicklung eines 3D-Konstrukts innerhalb einer Mikrokammer mittels Mikrofluidik. Obwohl dieser Artikel eine vereinfachte undifferenzierte Haut vorstellt, besteht das langfristige Ziel darin, ein vollständig differenziertes Hautkonstrukt zu generieren und zu charakterisieren, um seine Lebensfähigkeit und Funktionalität für arzneimittel- und kosmetische Testzwecke zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Motivation, diese Methode zu entwickeln, war der Wunsch, Hauterkrankungen zu modellieren und die Auswirkungen neuer und innovativer Therapien in einer Hochdurchsatzplattform zu untersuchen. Bis heute produziert dieses Labor diese dermo-epidermalen Äquivalente, indem es – entweder manuell oder mit Hilfe der 3D-Bioprinting-Technologie – das Fibringel mit Fibroblasten in eine Zellkultur-Einlegeplatte gießt und die Keratinozyten darauf aussät. Sobald die Keratinozyten den Zusammenfluss erreichen, wird die 3D-Kultur de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Javier Rodríguez, Dr. María Luisa López, Carlos Matellán und Juan Francisco Rodríguez herzlich für sehr hilfreiche Anregungen, Diskussionen und/oder vorläufige Daten. Wir danken auch den Beiträgen von Sergio Férnandez, Pedro Herreros und Lara Stolzenburg zu diesem Projekt. Besonderer Dank geht an Dr. Marta García für GFP-gekennzeichnete hFBs und hKCs. Schließlich würdigen wir die hervorragende technische Unterstützung von Guillermo Vizcaíno und Angélica Corral. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Projekt S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Diese Arbeit wurde auch durch das “Programa de excelencia”, Projekt EPUC3M03, CAM, unterstützt. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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