マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成
Summary
ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。
Abstract
この研究は、複雑な多層組織を生成する可能性を持つ新しい、費用対効果の高い、信頼性の高いマイクロ流体プラットフォームを提示します。概念実証として、真皮(間質)および表皮(上皮)コンパートメントを含む、簡素で未分化のヒト皮膚がモデル化されている。これを達成するために、2つのチャンバーに分かれた汎用性と堅牢なビニール系デバイスが開発され、高価で特殊な機器の使用や、小型の疎水性分子およびタンパク質の吸収など、生物医学の用途に適したポリジメチルシロキサン(PDMS)に基づくマイクロ流体デバイスに存在する欠点の一部を克服しました。さらに、平行流に基づく新しい方法が開発され、真皮および表皮コンパートメントの両方の イン・ザ・ポジション 堆積が可能となる。皮膚構築物は、ヒト原発性線維芽細胞を含むフィブリンマトリックスと、上に播種された不死化角化ケラチノサイトの単層から構成され、その後、動的培養条件下で維持される。この新しいマイクロ流体プラットフォームは、ヒトの皮膚疾患をモデル化し、他の複雑な組織を生成する方法を推定する可能性を開きます。
Introduction
近年、化粧品および医薬品1の毒性分析のためのヒト皮膚モデルの開発・生産に向けた進歩が見られている。医薬品およびスキンケア産業の研究者は、動物を使用してきました, マウスは最も一般的です, 自社製品をテストするために2,3,4,5.しかし、動物の試験製品は、ヒトにおける反応を予測するとは限らず、しばしばヒトにおける薬物不全または副作用を引き起こし、その結果経済的損失5,6に至る。英国は、1998年に化粧品検査のための動物の使用を禁止した最初の国でした。その後、2013年に、EUは動物の化粧品の試験と承認を禁止しました (EU化粧品規則第1223/2009)7.
この禁止は、米国の「人道的化粧品法」など他の国々でも検討されています。倫理的な懸念に加えて、動物と人間の皮膚の解剖学的な違いは、動物のテストに時間がかかり、高価で、しばしば効果がありません。さらに、世界 のインビトロ 毒物学の検査市場規模は、20259年までに269億8000万米ドルに達すると予想されています。これらの理由から、動物を使用せずに化粧品や薬物の安全性と毒性効果のテストを可能にする、バイオエンジニアリングされたヒト皮膚モデルなどの インビトロ 研究のための新しい方法と代替案を開発する必要があります。
市販の2種類、インビトロ、ヒトの皮膚モデルがあります。第1のタイプは、異なる材料に播種された分化角化細胞の複数の層を含む層状表皮等価物で構成される。そのうちのいくつかは経済協力開発機構(OECD)によって承認され、エピダームやSkinEthic10、11、12などの皮膚腐食および刺激試験のための(欧州代替方法検証センター(ECVAM)によって検証されています。第2のタイプは、T-SkinやEpiDerm-FTなどの線維芽細胞を含む3次元(3D)足場に播種されたヒトケラチノサイトの層を持つフルスキン同等物である。しかし、これらのモデルは静的な条件下で培養されるため、ヒトの生理学的状態を正確に表すことができません。
最近の関心は、動的灌流13、14、15、16、17、18、19の細胞培養挿入(CCI)フォーマットでin vitro 3Dスキンモデルを生成することに焦点を当てています。しかし、これらのシステムは、現場での古典的な定義に従って、マイクロ流体スキンオンチップとして厳密な感覚とは考えられません。Ingberの臓器オンチップの定義は、器官がマイクロ流体チャネルの中に配置されなければならないと述べています。スキンオンチップは、これまでのところ、多孔質膜22、23によって分離された単一細胞層および/または真皮細胞層として、ほとんどが単純な上皮をモデル化してきた。マイクロ流体系16,24では皮膚をモデル化する進歩がいくつかあったが、現在のところ、Ingberの定義に合った臓器オンチップシステムを示す文献はなく、その場で多層皮膚を産生することができ、上皮成分と間質成分の両方を含む。
この研究では、スキンオンチップアプリケーション用の新しい、費用対効果の高い、堅牢な、ビニールベースのマイクロ流体プラットフォームが発表されています。このプラットフォームは、PDMS25の制限の一部を克服し、デバイスのレイアウトにおける柔軟性と汎用性の向上と同様に、製造プロセスにおいてよりシンプルさを提供するマイクロ加工によって製造された。シリンジポンプで制御された平行流を通して簡単な皮膚構造を導入する方法も設計されました。平行流は非常に異なった粘着性を持つ2つの液体(この場合は緩衝液およびフィブリンプレゲル)が互いに混合されることなくチャネルを通して浸透することを可能にする。概念実証として、真皮を模したフィブリンマトリックスに埋め込まれた線維芽細胞を含む真皮構造をデバイスに導入し、その上にケラチノサイトの単層をロードして未分化表皮をエミュレートした。真皮コンパートメントの高さは流量を変更することによって変調することができる。この研究の主な目新しさは、前に説明したモデル22、26、27、28、29と比較して、マイクロ流体によるマイクロチャンバー内の3D構造の開発である。この記事では、未分化肌を単純化したものの、長期目標は、完全に差別化された皮膚構造を生成し、特徴付け、薬物および化粧品検査目的の生存率と機能性を実証することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法を開発する動機は、皮膚疾患をモデル化し、ハイスループットプラットフォームで新しい革新的な治療法の効果を研究したいという願望でした。現在までに、この研究室は、手動で、または3Dバイオプリンティング技術の助けを借りて、繊維芽細胞を含むフィブリンゲルを細胞培養インサートプレートに播種し、その上に角化細胞を播種することによって、これらの皮膚表皮等価物?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ハビエル・ロドリゲス博士、マリア・ルイサ・ロペス博士、カルロス・マテラン、フアン・フランシスコ・ロドリゲスの皆様に、ご意見、ご意見、ご意見、予備データをお願い申し上げます。また、セルヒオ・フェルランデス、ペドロ・エレーロス、ララ・ストルツェンブルクの貢献に感謝します。GFPラベル付きhFPとhKUについては、マルタ・ガルシア博士に感謝します。最後に、ギレルモ・ヴィズカイノとアンジェリカ・コラルの優れた技術支援を認めています。この作品は「プログラム・デ・アクティビダーデス・デ・I+Dアントル・グルポス・デ・インベスティガシオン・デ・ラ・コムニダード・デ・マドリード」、プロジェクトS2018/BAA-4480、バイオピエルテック-CMによって支えられた。この研究は、”プログラム・デ・エクセレンシア”、プロジェクトEPUC3M03、CAMによってもサポートされました。コンセヘリア・デ・エドゥカシオン・エ・インベスティガシオン
Materials
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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