Generazione di un modello skin-on-a-chip tridimensionale semplificato in una piattaforma microfluidica microlavorazione
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle tridimensionale semplificato e indifferenziato utilizzando una piattaforma microfluidica microlavorazione. Un approccio a flusso parallelo consente la deposizione in situ di un compartimento dermico per la semina di cellule epiteliali sulla parte superiore, il tutto controllato da pompe a siringa.
Abstract
Questo lavoro presenta una piattaforma microfluidica nuova, economica e affidabile con il potenziale per generare tessuti multistrato complessi. Come prova di concetto, è stata modellata una pelle umana semplificata e indifferenziata contenente un compartimento dermico (stromale) e un compartimento epidermico (epiteliale). Per raggiungere questo obiettivo, è stato sviluppato un dispositivo versatile e robusto, a base di vinile diviso in due camere, superando alcuni degli inconvenienti presenti nei dispositivi microfluidici a base di polidimetilsilossano (PDMS) per applicazioni biomediche, come l’uso di apparecchiature costose e specializzate o l’assorbimento di piccole molecole e proteine idrofobiche. Inoltre, è stato sviluppato un nuovo metodo basato sul flusso parallelo, che consente la deposizione in situ di entrambi i compartimenti dermico ed epidermico. Il costrutto cutaneo è costituito da una matrice di fibrina contenente fibroblasti primari umani e un monostrato di cheratinociti immortalizzati seminati sulla parte superiore, che viene successivamente mantenuto in condizioni di coltura dinamiche. Questa nuova piattaforma microfluidica apre la possibilità di modellare le malattie della pelle umana ed estrapolare il metodo per generare altri tessuti complessi.
Introduction
Recentemente, sono stati compiuti progressi verso lo sviluppo e la produzione di modelli in vitro di pelle umana per l’analisi della tossicità dei prodotti cosmetici e farmaceutici1. I ricercatori nelle industrie farmaceutiche e della cura della pelle hanno utilizzato animali, i topi sono i più comuni, per testare i loro prodotti2,3,4,5. Tuttavia, la sperimentazione di prodotti sugli animali non è sempre predittiva della risposta nell’uomo, che spesso porta a fallimento del farmaco o effetti avversi nell’uomo e di conseguenza a perdite economiche5,6. Il Regno Unito è stato il primo paese che ha vietato l’uso di animali per i test cosmetici nel 1998. Successivamente, nel 2013, l’UE ha vietato la sperimentazione e l’omologazione dei cosmetici negli animali (regolamento UE sui cosmetici n. 1223/2009)7.
Questo divieto è anche preso in considerazione da altri paesi come in “The Humane Cosmetics Act” negli Stati Uniti8. Oltre alle preoccupazioni etiche, le differenze anatomiche tra pelle animale e umana rendono la sperimentazione animale dispendiosa in termini di tempo, costosa e spesso inefficace. Inoltre, si prevede che le dimensioni del mercato globale dei test tossicologici in vitro raggiungeranno i 26,98 miliardi di dollari entro il 20259. Per questi motivi, è necessario sviluppare nuovi metodi e alternative per quegli studi in vitro, come i modelli bioingegnerizzati della pelle umana, che consentono di testare la sicurezza e gli effetti tossici di cosmetici e farmaci senza l’uso di animali.
Esistono due diversi tipi di modelli di pelle umana disponibili in commercio, in vitro. Il primo tipo è costituito da equivalenti epidermici stratificati contenenti più strati di cheratinociti differenzianti che vengono seminati su materiali diversi. Alcuni di essi sono stati approvati dall’Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) e convalidati dal Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (ECVAM) per i test di corrosione e irritazione cutanea, come EpiDerm o SkinEthic10,11,12. Il secondo tipo sono equivalenti a pelle intera con uno strato di cheratinociti umani differenzianti seminati su un’impalcatura tridimensionale (3D) che contiene fibroblasti, come T-Skin ed EpiDerm-FT. Tuttavia, questi modelli sono coltivati in condizioni statiche, il che li rende incapaci di rappresentare con precisione le condizioni fisiologiche umane.
L’interesse recente si è concentrato sulla generazione di modelli cutanei 3D in vitro in formati di inserto di coltura cellulare (CCI) con perfusione dinamica13,14, 15,16,17,18,19. Tuttavia, questi sistemi non possono essere considerati stricto sensu come skin-on-chip microfluidici secondo la loro definizione classica nel campo. La definizione di Ingber per organs-on-a-chip afferma che l’organo deve essere collocato all’interno dei canali microfluidici, che è una condizione che solo pochi dispositivi soddisfano20,21. Skin-on-chips hanno finora modellato per lo più epiteli semplici come strati unicellulari e / o strati cellulari dermici separati da una membrana porosa22,23. Sebbene ci siano stati alcuni progressi nella modellazione della pelle nei sistemi microfluidici16,24, attualmente non esiste letteratura che mostri un sistema organ-on-a-chip che si adatti alla definizione di Ingber, in grado di produrre una pelle multistrato in situ e comprendente sia componenti epiteliali che stromali.
In questo lavoro, viene presentata una nuova piattaforma microfluidica a base di vinile, economica, robusta e per applicazioni skin-on-a-chip. Questa piattaforma è stata prodotta mediante micro-lavorazione, che fornisce maggiore semplicità nel processo di fabbricazione, nonché una maggiore flessibilità e versatilità nel layout del dispositivo, superando alcuni dei limiti di PDMS25. È stato inoltre progettato un modo per introdurre un costrutto cutaneo semplificato attraverso un flusso parallelo controllato con pompe a siringa. Il flusso parallelo consente di perfusare due fluidi con viscosità molto diverse (un tampone e un pre-gel di fibrina in questo caso) attraverso un canale senza mescolarsi tra loro. Come prova di concetto, nel dispositivo è stato introdotto un costrutto dermo-epidermico contenente fibroblasti incorporati in una matrice di fibrina che imita il derma, in cima al quale è stato caricato un monostrato di cheratinociti per emulare l’epidermide indifferenziata. L’altezza del compartimento dermico può essere modulata modificando le portate. La principale novità di questo lavoro, rispetto ai modelli precedentemente descritti22,26,27,28,29,è lo sviluppo di un costrutto 3D all’interno di una microcamera per mezzo della microfluidica. Sebbene questo articolo presenti una pelle indifferenziata semplificata, l’obiettivo a lungo termine è quello di generare e caratterizzare un costrutto cutaneo completamente differenziato per dimostrare la sua vitalità e funzionalità a scopo di test farmacologici e cosmetici.
Protocol
Representative Results
Discussion
La motivazione per sviluppare questo metodo è stato il desiderio di modellare le malattie della pelle e studiare gli effetti di terapie nuove e innovative in una piattaforma ad alto rendimento. Ad oggi, questo laboratorio produce questi equivalenti dermo-epidermici colando – manualmente o con l’aiuto della tecnologia di bioprinting 3D – il gel di fibrina con fibroblasti in una piastra di inserto per colture cellulari e seminando i cheratinociti sopra di esso. Una volta che i cheratinociti raggiungono la confluenza, la c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo sinceramente il Dr. Javier Rodríguez, la Dott.ssa María Luisa López, Carlos Matellán e Juan Francisco Rodríguez per suggerimenti, discussioni e/o dati preliminari molto utili. Ringraziamo anche i contributi di Sergio Férnandez, Pedro Herreros e Lara Stolzenburg a questo progetto. Un ringraziamento speciale va alla dottoressa Marta García per gli hFB e gli hCC con etichetta GFP. Infine, riconosciamo l’eccellente assistenza tecnica di Guillermo Vizcaíno e Angélica Corral. Questo lavoro è stato sostenuto dal “Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid”, Progetto S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Questo lavoro è stato sostenuto anche dal “Programa de excelencia”, Progetto EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.
Materials
| Amchafibrin | Rottafarm | Tranexamic acid | |
| Antibiotic/antimycotic | Thermo Scientific HyClone | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Culture plates | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Double-sided tape vynil | ATP Adhesive Systems | GM 107CC, 12 µm thick | |
| Edge plotter | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extracted from human plasma | |
| Glass slide | Thermo Scientific | ||
| GFP-Human dermal fibroblasts | – | Primary. Gift from Dr. Marta García | |
| H2B-GFP-HaCaT cell line | ATCC | Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García | |
| Live/dead kit | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Polycarbonate membrane | Merk TM | 5 µm pore size | |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | ||
| Syringes | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/vial | |
| Transparent adhesive vinyl | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µm thick | |
| Trypsin/EDTA | Sigma Aldrich | ||
| Tubing | IDEX | Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID |
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