Здесь мы предоставляем пошаговой протокол с советами по генерации ксенотрансплантатов и руководящими принципами для анализа поведения опухолей, иммунофлуоресценции целых гор и количественной оценки конфокальных изображений.
Ксенотрансплантаты зебры широко используются для исследования рака для выполнения in vivo и в режиме реального времени исследований рака человека. Возможность быстрой визуализации реакции на противораковой терапии (химио, лучевая терапия и биология), ангиогенез и метастазы с разрешением одной клетки, ставит модель ксенотрансплантата зебры в качестве лучшего выбора для разработки доклинкологических исследований.
Анализ личинки зебры ксенотрансплантата представляет несколько экспериментальных преимуществ по сравнению с другими моделями, но, вероятно, наиболее ярким является уменьшение масштабов размера и, следовательно, времени. Такое уменьшение масштаба позволяет одноклеточной визуализации, использование относительно небольшого числа клеток человека (совместимых с биопсией), средне-высокой пропускной способности скрининга наркотиков, но самое главное позволяет значительно сократить время анализа. Все эти преимущества делают анализ ксенотрансплантата зебры чрезвычайно привлекательным для будущих персонализированных приложений медицины.
Многие протоколы ксенотрансплантата зебры были разработаны с широким разнообразием опухолей человека; однако, общий и стандартизированный протокол для эффективного создания личинки зебры ксенотрансплантатов по-прежнему отсутствует. Здесь мы предоставляем пошаговой протокол, с советами по генерации ксенотрансплантатов и руководящих принципов для анализа поведения опухоли, цельно-монтаж иммунофлуоресценции, и конфокальные количественной визуализации.
Зебрафиш (Danio rerio) становится мощным позвоночным моделью организма для изучения развития и болезней. Зебрафиш разделяет высокосхраняемые генетические (70% генетической гомологии и 84% связанных с болезнью генов) и основные морфологическиеособенности органов с людьми 1,2. Эта консервация позволяет использовать зебру для моделирования нескольких заболеваний человека, в том числерака 3,4.
Обработка и обслуживание зебры гораздо проще и рентабельнее, чем мыши из-за их небольшого размера, высокой плодовитости круглый год ивнешнего оплодотворения 3,5. Эмбрионы зебры не требуют живого кормления в течение первых 5-7 дней жизни и были использованы в качестве эффективной модели для развития, инфекции ирака 1,4,6,7. Эмбрионы зебры вылупляются в течение 48 часов после оплодотворения (hpf) и являются свободно плавающими животными со всеми сформированными органами, бьющимся сердцем и функциональной кровеносной системой, печенью, мозгом, мозгом, мозгом ит.д. 1,3. Также на данном этапе развития только врожденный иммунитет находится в игре, адаптивный иммунитет все еще развивается, что позволяет общее эффективное присвещание клеток человека без необходимости использования иммунокомпромиссныхмутантов 7,8. Тем не менее, важно отметить, что не все клетки человека engraftодинаково 9 и что, например, для клеток лейкемии было показано, что фагоциты (нейтрофилов и макрофагов) должны быть истощены для эффективного притягаения10.
Генетическая трактивность зебры и оптическая прозрачность ее ранних эмбриональных стадий позволяют одноклеточную интравитационную визуализацию с высоким разрешением и, таким образом, для создания самых современной техники визуализации в различных областях биологии. Кроме того, в контексте рака, эти функции полезны для в режиме реального времени исследования ранних стадиях взаимодействия хозяина-опухоли, как изучение ангиогенного и метастатического потенциала, а также взаимодействия с врожденнойиммунной системой 8,9,11,12,13.
Хотя в коротком анализе ксенотрансплантата нет времени на метастатическую «эволюцию» – можно проанализировать метастатические способности опухолевых клеток (т.е. их эффективность пройти через метастатические шаги вроде вторжения, интравазации, выживания в кровообращении, экстравазации и колонизации, и поэтому изучить эти процессы в виво ив режиме реального времени 8,11,13,14).
Характеристики его жизненного цикла место зебры в качестве уникальной модели для персонализированной медицины в раке. Анализы могут быть выполнены в более короткий промежуток времени ирезультаты,полученные в течение нескольких недель 7,8,9,11,12,15,16. Селерность и осуществимость этих анализов предоставляют врачам и исследователям возможность получения трансляционных результатов, которые могут быть полезны для онкологических больных, для которых время является существенной необходимостью.
Несмотря на все более все более многочисленные попытки создания успешных ксенотрансплантатов эмбрионов зебры, по-прежнему существует необходимость в стандартизации процедуры инъекций, а также оценки жизнеспособности клеток и поведения опухоли после инъекции.
В этом протоколе мы предоставляем исследователям четкое и подробное пошаговое руководство для инъекций линий раковых клеток человека в эмбрионах зебры и последующей фиксации, иммуностеинации, визуализации и количественной оценки поведения опухолевых клеток.
Растущее значение зебры в качестве модели для развития рака и скрининга наркотиков привело к многочисленнымпубликациям 3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. Тем не менее, инъекция раковых клеток в эмбрионы зебры является метод, который требует высокого уровня ловкости, которая может быть сложной задачей для исследователей. В этом протоколе мы стремимся предоставить практическую информацию и некоторые советы, которые могут помочь преодолеть первоначальные проблемы создания ксенотрансплантатов эмбрионов зебры.
Обработка клеток до инъекций
Этот оптимизированный протокол для генерации ксенотрансплантатов зебры с клеточными линиями может быть адаптирован к различным типам (раковых) клеток с различными морфологиями. Мы рекомендуем, чтобы все клеточные линии, используемые для ксенотрансплантатов зебры, не являются микоплазмой. В отличие от других бактериальных загрязнений, наличие микоплазмы в клеточной культуре не генерирует изменений, которые можно легко обнаружить под микроскопом22. Загрязнение микоплазмой может повлиять на потенциал присвящания клеточных линий, их чувствительность к препаратам, а также жизнеспособность эмбрионов зебры.
Хотя клетки могут продолжать размножаться в течение длительного периода времени, их фенотип и генотип могут быть подвержены изменениям. Важно ознакомиться с морфологией и поведением клеточных линий в культуре. Мы рекомендуем сохранить количество проходов клеток после оттаивания между 3-12, чтобы получить воспроизводимые результаты. Таким образом, необходимо проводить регулярные микоплазма-тесты.
Клетки должны быть на стадии регистрации (экспоненциальная фаза роста до достижения слияния 70%) в день инъекции. Это позволит адекватное привещание и надлежащее развитие отличительных признаков опухоли. Для предотвращения изменения фенотипа клеток в ксенотрансплантате, крайне важно поддерживать слияние для инъекций постоянной между экспериментами. Количество инъекционных клеток может быть адаптировано к характеристикам каждой клеточной линии, так как некоторые из них могут потребовать более высокой плотности инъекций, чтобы процветать в эмбрионах зебры.
Соображения маркировки ячеей
Чтобы лучше визуализировать опухолевые клетки человека для инъекций и будущего анализа, опухолевые клетки могут быть помечены флуоресцентными красителями. Из-за различий в размерах клеток, общее количество клеток/см 2 вкультурах адептов варьируется между клеточными линиями. Это повлияет на эффективность протокола окрашивания, а также количество клеток, собранных для инъекций. Большие ячейки, которые дают низкие цифры на колбу (т.е. Hs578T) или растут в кластерах (т.е. BFTC905) потребует объединения нескольких колб для одного эксперимента. В этом случае окрашивание клеток не должно проводиться непосредственно в колбе, так как это приведет к использованию чрезмерного количества красителя (высокая стоимость). С другой стороны, клетки, которые очень чувствительны к чрезмерным циклам центрифугации, а также те, которые дают большое количество на колбу (т.е. HCT116) могут быть окрашены непосредственно в колбе, а затем отделены от EDTA / cell скребок (Для получения дополнительной информации см. таблицу 1).
Всякий раз, когда это возможно, вместо того, чтобы использовать энзиматический подход, используйте ЭДТА, чтобы отделить клетки в день инъекции, так что клетки восстанавливают свои клеточно-клеточные соединения быстрее и подвергаются меньшей центрифугации шагов. Тем не менее, если клетки чувствительны к ЭДТА, очень привержены или растут в кластерах – можно применить энзиматический метод. Оптимизация идеальной концентрации для инъекций, а также среды инъекций зависит от характеристик каждой клеточной линии, поэтому может потребоваться некоторые корректировки(таблица 1).
Калибровка микроинъекции
Вопреки доставке олигонуклеотидов или препаратов в эмбрион зебры, гратикула не используется для калибровки иглы при работе с клеточными линиями для ксенотрансплантата. Через некоторое время во время инъекции клетки начнут закупоривания, и необходимо сократить кончик иглы, чтобы увеличить ее диаметр или изменить иглу вообще. Эта процедура препятствует калибровке решетки.
Для решения этой проблемы количество дозированных клеток регулируется давлением и временем выброса, необходимым для достижения размера, аналогичного глазу эмбриона в пределах 1-3 импульсов. Затем, для дальнейшего контроля размера опухоли, на 1 dpi, ксенотрансплантаты сортируются в соответствии с размером опухоли, как показано на рисунке 6 B-B “. Как по представлено в примере рисунка 6C, этот метод сортировки эффективен в снижении вариации размеров опухоли: если мы удвоим их все вместе (я, Кью, З) STEV является «двойным из класса » (906 клеток до 422 клеток), а изменение коэффициента составляет 31,9% по сравнению с 14,5% в классе. Поскольку ссылка на инъекцию является объемной, общее количество клеток сильно варьируется между типами клеток – зависит от размера и формы клеток. Например, большие клетки с большим количеством цитоплазмы, как рак молочной железы Hs578T, производят гораздо меньшие опухоли (600 клеток). Кроме того, каждая линия ячейки требует разного количества ячеек. Например, линии клеток рака мочевого пузыря HT29 CRC и RT112 показали, что чем выше количество вводимых клеток, тем выше смертность от зебры. Таким образом, период оптимизации при разработке ксенотрансплантата необходим для проверки, если линия клеток имеет токсическое воздействие на эмбрион или требует более высокой/нижней плотности инъекций.
Сайт инъекций
Одним из наиболее распространенных расхождений при генерации ксенотрансплантата зебры является место инъекции. Как правило, желток является местом выбора для инъекций из-за его легкой доступности. Тем не менее, мы заметили, что клетки, введенные в желток имеют более высокую тенденцию к смерти. Хотя технически сложнее, мы рекомендуем инъекционных ВИО и, насколько это возможно от сердца. В pvS, клетки могут агрегировать, набирать сосуды и иммунные клетки, и мигрировать, интравазат, экстравазат и образуют микрометастаз, если они отображаютметастатические характеристики 8,11.
Эффективность привязания
Различия в эффективности engraftment и размер опухоли среди клеточных линий на 4 dpi, как ожидается, из-за их различных степеней базально-клеточной смерти / выживания / распространения, но и из-за врожденной иммуногенности, что каждая линия клеток можетотображать 9.
метастаз
Метастаз состоит из многоступенчатого каскада событий, которые можно разделить на два произвольных этапа. На первом этапе опухолевые клетки должны отделяться от основного участка, мигрировать и вторгаться в соседние ткани, а затем интравазать в кровоток. На втором этапе опухолевые клетки должны выживать в циркуляции, экстравазать из крови или лимфатических сосудов, и, наконец, колонизировать на вторичныхучастках 23. Чтобы провести различие между этими ранними и поздними событиями и рассмотреть потенциал / знание различных опухолевых клеток для выполнения этих шагов, мы разработали простой анализ.
В целом, при введении в ПВХ опухолевые клетки могут входить непосредственно в кровообращение, а затем физически попасть в хвостовую гематопоэтическую ткань (CHT) (хвостовая область). Однако, в соответствии с характеристиками каждой опухолевой клетки – мы видели, что некоторые опухолевые клетки остаются на CHT 4 dpi и способны образовывать микрометастаз, в то время как другие опухолевые клетки исчезают (очищены после того, как попали в CHT).
Таким образом, сравнивая эффективность микрометастасиса (на 4 dpi), когда клетки были помещены непосредственно в циркуляцию – CIRC (клетки только должны пройти через поздние шаги метастазирования) против, когда нет – NO CIRC (клетки должны пройти через ранние и поздние шаги, чтобы иметь возможность сформировать микрометастаз) мы можем оценить их ранний или поздний метастатический потенциал. Мы наблюдали опухолевые клетки, которые могут эффективно формировать микрометастаз в CHT в обеих группах (CIRC и NO CIRC), предполагая, что эти клетки имеют возможность пройти все этапы метастатического каскада (SW480 и MDA-MB-468например) 8,11. В отличие от этого, другие опухолевые клетки имеют очень низкий метастатический потенциал в обеих группах, почти никогда не делая микрометастаза, даже при введении в циркуляцию (т.е. видимые в CHT на 24 л.с., но при 4 dpi они больше не существует, Hs578Tнапример) 8. Тем не менее, мы четко нашли другую группу – такую, которая способна формировать микрометастаз только при введении в циркуляцию (мы можем наблюдать только микрометастаз в группе CIRC). Это говорит о том, что эти клетки имеют низкую эффективность в выполнении первых шагов метастатического каскада, но с другой стороны, способны выжить в циркуляции, экстравазать и колонизировать отдаленный участок.
Иммуностиминг и визуализация
Перед фиксацией этот протокол инъекций может быть использован для других живых подходов к визуализации, таких как интерскопия контрастного дифференциального интерференции (DIC), вращающаяся микроскопия диска с высоким разрешением, живая конфокаленная визуализация и микроскопия светового листа и т.д.
Мертвые клетки и клеточный мусор появляются яркие при наблюдении через флуоресцентный стереомикроскоп и могут быть ошибочно приняты за живые клетки, особенно если целью исследования является оценка метастатического потенциала клеточных линий. Мы хотели бы подчеркнуть важность выполнения конфокальных изображений с конкретными маркерами жизнеспособности и DAPI для оценки состояния выживаемости опухоли и микрометастаса. Кроме того, важно использовать специфические человеческие антитела для обнаружения человеческих клеток, таких как анти-человеческие митохондрии или анти-человеческой HLA. При реализации протокола тренируйте глаза экспериментатора, сравнивая окрашивание в стереомикроскопе с конфокальные изображения. Через некоторое время экспериментаторы могут четко отличить мусор от живых клеток в флуоресцентном стереомикроскопе.
Хотя широко используются другие методы количественной оценки бремени опухоли, такие как целая флуоресценция, мы рекомендуем выполнять иммуностимментацию и конфоканую визуализацию в качестве более точного метода. Не только эффективность липофильных красителей окрашивания очень изменчива (т.е. некоторые клетки очень хорошо окрашены в то время как другие не -вероятно, из-за содержания липидов в их мембранах), но и много раз липофильные красители образуют агрегаты, и мертвые клетки, как правило, ярче – создание нескольких артефактов, которые могут быть ошибочно приняты за живые клетки.
Клетки могут быть трансуцированы флуоресцентными белками, чтобы помочь в их отслеживании и пропустить маркировку клеток. Однако убедитесь, что транс индуцированные и нетранспрививные клетки производят те же результаты в ксенотрансплантатах зебры.
Кроме того, макрофаги могут фагоцитов этих флуоресцентных клеточных мусора становится флуоресцентно помечены и мигрировать, генерации ложноположительных метастатических клеток. Таким образом, мы рекомендуем ряд аналитических инструментов, которые, конечно, могут быть распространены на многие другие считывания для более точной интерпретации поведения опухоли:
Для конфокального приобретения с интервалом в 5 мкм между ломтиками в стеке контрольных раковых клеток HCT116 (средний ядерный размер 10-12 мкм диаметра) с помощью счетчиков DAPI мы заметили, что 50% клеток делятся между двумя последовательными ломтиками. Поэтому, если каждый кусочек подсчитан, существует высокий риск подсчета одной и той же клетки дважды. Переход взад и вперед между ломтиками, чтобы избежать проблем в количественной оценке приводит к отовремени и подверженных ошибкам техники. Чтобы облегчить количественную оценку общего количества клеток и обеспечить более воспроизводимость между исследователями, мы создали формулу размера опухоли, ранее описанную в этомпротоколе 8.
Мы включили номер коррекции (1,5), чтобы учесть ячейки в размере 50%, которые делятся между ломтиками. Мы обнаружили, что средняя погрешность ручного подсчета всей опухоли между исследователями составила 20%. Два исследователя, использующие формулу, имели погрешность 2%. Использование этой формулы имеет 93% точность и 98% воспроизводимость. Мы также протестировали автоматизированные методы, но они продемонстрировали ошибку выше 50%, вызванную настройками порога.
Из-за особенностей апоптотических клеток, количественная оценка активированных клеток Caspase 3 сложнее. Чтобы уменьшить количество ошибок и вариаций в результатах, мы рекомендуем, чтобы контрольные и экспериментальные образцы были подсчитаны одним и тем же исследователем. Кроме того, при изучении этого метода, новый исследователь должен подсчитать изображения, которые уже были количественно более опытных исследователей для сравнения результатов и подготовки.
При необходимости продолжительность анализа может быть увеличена. Тем не менее, важно учитывать, что личинки зебры требуют живого кормления, начиная с 7 дней после оплодотворения (5 дней после инъекции). Кроме того, руководящие принципы и положения, применяемые к личинкам старше 6 дней после оплодотворения, могут варьироваться.
Этот протокол предоставляет полезные инструменты, позволяющие одному исследователю вводить примерно 200-300 личинок зебры в час; и результаты полного анализа, включая анализ и статистическое толкование, полученные за три недели. Мы надеемся, что этот протокол поможет исследователям стать экспертами в генерации ксенотрансплантатов зебры. Это не просто; Вы должны практиковать, но вы получите там. Удачи!
The authors have nothing to disclose.
Благодарим Фонд Шампалауда, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, совместно финансируемый FCT/Lisboa2020) для финансирования. Стипендии FCT для вице-президента (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Все члены лаборатории Fior для критических обсуждений; Б. Коста и К. Ребелу де Алмейда для обмена данными; и члены нашей лаборатории К. Ребело де Алмейда, М. Баррозу и Л. Лейт за участие в видео. Мы хотели бы поблагодарить CF Рыбный фонд (C. Certal, J. Монтейру и др.) и Champalimaud связи, событий и информационно-пропагандистской команды, в частности Александр Azinheira за фантастический фильм решений и Катарина Рамос и Тереза Фернандес за их помощь.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |