כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסוניות של כל ההר, וכימות הדמיה confocal.
זברות זברה קסנוגרפטים נמצאים בשימוש נרחב לחקר הסרטן לבצע vivo ומחקרים בזמן אמת של סרטן האדם. האפשרות לדמיין במהירות את התגובה לטיפולים אנטי סרטניים (כימותרפיה, הקרנות וביולוגיות), אנגיוגנזה וגרורות ברזולוציה של תא יחיד, מציבה את מודל קסנוגרפט זברה-דג כבחירה עליונה לפתח מחקרים פרה-קוליניים.
זברת הזברה xenograft assay מציג מספר יתרונות ניסיוניים בהשוואה לדגמים אחרים, אבל כנראה הבולט ביותר הוא הפחתת סולם גודל וכתוצאה מכך זמן. הפחתה זו של קנה המידה מאפשרת הדמיה של תא יחיד, שימוש במספר נמוך יחסית של תאים אנושיים (תואמים לביופסיות), הקרנות סמים בעלות תפוקה בינונית-גבוהה, אך הכי חשוב מאפשרת הפחתה משמעותית של זמן הבדיקה. כל היתרונות הללו הופכים את מבחני הקסנוגרפט של דגי הזברה לאטרקטיביים ביותר עבור יישומי רפואה מותאמים אישית עתידיים.
פרוטוקולי קסנוגרפט רבים של דגי זברה פותחו עם מגוון רחב של גידולים אנושיים; עם זאת, פרוטוקול כללי ומתוקנן כדי ליצור ביעילות זברה זחל זנגוגרפטים עדיין חסר. כאן אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסונות בכל ההר, וכימות הדמיה confocal.
זברהפיש (דניו ריו) מתגלה כאורגניזם מודל בעל חוליות רב עוצמה לחקר התפתחות ומחלות. זברה-פיש חולקת תכונות גנטיות שמורות מאוד (כ-70% הומולוגיה גנטית ו-84% גנים הקשורים למחלות) ותכונות מורפולוגיות בסיסיות של איברים עם בני אדם1,2. שימור זה מאפשר שימוש בזברהפיש כדי לדגמן מספר מחלות אנושיות, כולל סרטן3,4.
הטיפול והתחזוקה של דגי זברה הוא הרבה יותר קל וחסכוני יותר מאשר עכברים בשל גודלם הקטן, פוריות גבוהה כל השנה והפריה חיצונית3,5. עוברי זברה אינם דורשים האכלה חיה במהלך 5-7 הימים הראשונים לחייהם ושימשו כמודל יעיל להתפתחות, זיהום וסרטן1,4,6,7. עוברי זברה בוקעים במהירות של 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) והם בעלי חיים שוחים חופשיים עם כל האיברים שנוצרו, לב פועם ומערכת דם תפקודית, כבד, מוח, מוח כליות וכו‘1,3. כמו כן, בשלב זה של התפתחות רק חסינות מולדת היא במשחק, חסינות אדפטיבית עדיין מתפתחת, המאפשר תחריט יעיל כללי של תאים אנושיים ללא צורך בשימוש במוטנטים immunocompromised7,8. עם זאת, חשוב לציין כי לא כל התאים האנושיים לחרוט באופן שווה9 וכי, למשל, עבור תאי לוקמיה הוכח כי phagocytes (נויטרופילים ומקפאגים) צריך להיות מדולדל עבור תחריט יעיל10.
המתיחה הגנטית של דג הזברה והשקיפות האופטית של שלבי העובר המוקדמים שלה מאפשרים הדמיה תוך-חיים של תא יחיד ברזולוציה גבוהה ובכך, להקמת טכניקות הדמיה מתקדמות בתחומים מגוונים של ביולוגיה. יתר על כן, בהקשר של סרטן, תכונות אלה שימושיות למחקרים בזמן אמת של השלבים המוקדמים ביותר של אינטראקציות מארח-גידול, כמו לימוד פוטנציאל אנגיוגני גרורתי, כמו גם אינטראקציות עם המערכת החיסונית המולדת8,9,11,12,13.
אמנם במבחן קסנוגרפט קצר אין זמן “אבולוציה” גרורתית – ניתן לנתח את היכולת גרורתית של תאי הגידול (כלומר, היעילות שלהם לעבור צעדים גרורתיים כמו פלישה, intravasation, הישרדות במחזור, פזרנות, קולוניזציה, ולכן ללמוד תהליכים אלה vivo ובזמן אמת8,11,13,14).
מאפייני מחזור החיים שלו מציבים את הזברה-פיש כמודל ייחודי לרפואה מותאמת אישית בסרטן. מבחנים יכולים להתבצע בפרק זמן קצר יותר ותוצאות המתקבלות בכמה שבועות7,8,9,11,12,15,16. הסלריות וההיתכנות של מבחנים אלה מספקים לרופאים ולחוקרים את האפשרות להשיג תוצאות תרגום שיכולות להיות שימושיות לחולי סרטן, שעבורם הזמן הוא צורך חיוני.
למרות הניסיונות הגוברים לייצר קסנוגרפטים מוצלחים לעובר זברה, עדיין יש צורך בתקינה של הליך ההזרקה, כמו גם בהערכת הכדאיות של התא והתנהגות הגידול לאחר ההזרקה.
בפרוטוקול זה אנו מספקים לחוקרים מדריך ברור ומפורט צעד אחר צעד להזרקת קווי תאים סרטניים אנושיים בעוברים של דגי זברה וקיבעון, חיסוני, הדמיה וכימות של התנהגות תאי הגידול.
החשיבות הגוברת של דג הזברה כמודל להתפתחות סרטן והקרנת תרופות הביאה לפרסומים רבים3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. עם זאת, הזרקת תאים סרטניים בעוברים זברה הוא טכניקה הדורשת רמה גבוהה של דרגה אשר יכול להיות מאתגר עבור החוקרים. בפרוטוקול זה אנו שואפים לספק מידע מעשי וכמה טיפים שיכולים לעזור להתגבר על האתגרים הראשוניים של הגדרת קסנוגרפטים עובר זברה.
טיפול בתאים לפני הזרקה
זה פרוטוקול אופטימיזציה עבור הדור של קסנוגרפטים זברה עם קווי תאים ניתן להתאים סוגים שונים של (סרטן) תאים עם morphologies שונים. אנו ממליצים כי כל קווי התא המשמשים קסנוגרפטים זברה-פיש הם ללא mycoplasma. שלא כמו זיהומים חיידקיים אחרים, נוכחות של mycoplasma בתרבית התא אינו יוצר שינויים שניתן לזהות בקלות תחת מיקרוסקופ22. זיהום Mycoplasma עשוי להשפיע על פוטנציאל החריטה של קווי התא, הרגישות שלהם לסמים, כמו גם את הכדאיות של עוברי זברה.
למרות שהתאים עשויים להמשיך להתרבות לתקופה ממושכת, הפנוטיפ והגנוטיפ שלהם עשויים להיות מועדים לשינויים. חשוב להכיר את המורפולוגיה וההתנהגות של קווי התאים בתרבות. אנו ממליצים לשמור על מספר מעברי התא לאחר הפשרה בין 3-12 כדי לקבל תוצאות לשחזור. לכן, בדיקות mycoplasma רגיל צריך להתבצע.
תאים צריכים להיות בשלב יומן הרישום שלהם (שלב צמיחה מעריכי לפני הגעה להתכנסות ~ 70%) ביום ההזרקה. זה יאפשר חריטה נאותה ופיתוח נאות של סימני ההיכר הייחודיים של הגידול. כדי למנוע וריאציה של פנוטיפ של תאים בתוך xenograft, זה קריטי כדי לשמור על המפגש עבור קבוע הזרקה בין ניסויים. מספר התאים מוזרקים יכול להיות מותאם למאפיינים של כל קו תאים כמו כמה עשויים לדרוש צפיפויות גבוהות יותר של הזרקה על מנת לשגשג בעוברים זברה.
שיקולי תיוג תאים
כדי לדמיין טוב יותר תאים סרטניים אנושיים להזרקה וניתוח עתידי, תאים סרטניים יכולים להיות מסומנים עם צבעים פלואורסצנטיים. בשל הבדלים בגודל התא, המספר הכולל של תאים / ס”מ 2 בתרביות חסידים משתנהבין קווי התא. זה ישפיע על היעילות של פרוטוקול הכתם, כמו גם את מספר התאים שנקטפו להזרקה. תאים גדולים המניבים מספרים נמוכים לכל בקבוקון (כלומר, Hs578T) או גדלים באשכולות (כלומר, BFTC905) ידרשו איגום של מספר בקבוקונים לניסוי יחיד. במקרה זה, הכתמת תאים לא צריך להתבצע ישירות בבקבוק כמו זה יגרום לשימוש בכמויות מוגזמות של צבע (עלות גבוהה). מצד שני, תאים רגישים מאוד מחזורים מוגזמים של צנטריפוגה, כמו גם אלה המניבים מספרים גבוהים לכל בקבוק (כלומר, HCT116) יכול להיות מוכתם ישירות בבקבוק ולאחר מכן מנותק עם מגרד EDTA / תא (לקבלת מידע נוסף ראה טבלה 1).
במידת האפשר, במקום להשתמש בגישה אנזימטית, להשתמש EDTA כדי לנתק את התאים ביום ההזרקה, כך תאים לשחזר צמתים התא שלהם במהירות רבה יותר והם נתונים פחות צעדי צנטריפוגה. עם זאת, אם התאים רגישים EDTA, מאוד חסידים או לגדול באשכולות – שיטה אנזימטית ניתן ליישם. אופטימיזציה של הריכוז האידיאלי להזרקה, כמו גם את מדיום ההזרקה תלוי במאפיינים של כל קו תא, ולכן זה עשוי להזדקק כמה התאמות (טבלה 1).
כיול מיקרו-שינג
בניגוד למסירת אוליגונוקלאוטידים או סמים לעובר זברה, גרטיקולה אינה משמשת לכיול המחט בעת עבודה עם קווי תאים עבור קסנוגרפטים. לאחר זמן מה במהלך ההזרקה, התאים יתחילו לסתום, ויש צורך לחתוך את קצה המחט כדי להגדיל את קוטרו או לשנות את המחט לגמרי. הליך זה מעכב את כיול הגרטיקולה.
כדי לטפל בבעיה זו, מספר התאים שניתנו מוסדר על ידי לחץ נפלט וזמן הדרוש כדי להגיע לגודל דומה לעין העובר בתוך 1-3 פולסים. לאחר מכן, כדי לשלוט עוד יותר בגודל הגידול, ב- 1 dpi, קסנוגרפטים ממוינים לפי גודל הגידול כפי שמוצג באיור 6 B-B”. כפי המיוצג בדוגמה של איור 6C, שיטת מיון זו יעילה בהפחתת הווריאציה של גדלי הגידול: אם אנו אוגדים את כולם יחד (+, ++, ++) STEV הוא ~ כפול מהמחלקה ++(~ 906 תאים ~ 422 תאים) והווריאציה המקדם היא ~ 31.9% לעומת 14,5% במחלקה ++. מאז ההפניה להזרקה היא נפח, המספר הכולל של תאים משתנה הרבה בין סוגי תאים – להיות תלוי בגודל ובצורה של התאים. לדוגמה, תאים גדולים עם הרבה ציטופלסמה כמו סרטן השד Hs578T, לייצר גידולים קטנים בהרבה (~ 600 תאים). כמו כן, כל קו תא דורש מספר תאים שונה. לדוגמה, קווי התאים סרטניים שלפוחית השתן HT29 CRC ו- RT112 הראו כי ככל שמספר התאים שהוזרקו גבוה יותר, כך התמותה של דגי הזברה גבוהה יותר. לכן, תקופה של אופטימיזציה בעת פיתוח xenografts יש צורך לבדוק אם קו התא יש השפעות רעילות בעובר או דורש צפיפויות גבוהות / נמוכות יותר של הזרקה.
אתר הזרקה
אחד הפערים הנפוצים ביותר בעת יצירת קסנוגרפטים עובר זברה הוא אתר ההזרקה. החלמון הוא בדרך כלל מקום הבחירה להזרקה בשל הנגישות הקלה שלה. עם זאת, ראינו כי תאים מוזרקים חלמון יש נטייה גבוהה יותר למות. למרות שטכנית קשה יותר, אנו ממליצים להזריק ב- PVS וככל האפשר מהלב. בתוך PVS, תאים יכולים לצבור, לגייס כלי דם ותאי חיסון, ולהגר, intravasate, אקסטרווסטזיס וליצור micrometastasis, אם הם מציגים מאפיינים גרורתיים8,11.
יעילות חריטה
הבדלים ביעילות החריטה וגודל הגידול בין קווי תאים ב 4 dpi צפויים בשל דרגות ברורות של מוות תאים בסיסיים / הישרדות / התפשטות, אלא גם בשל האימונוגניות המולדת כי כל קו תא עשוי להציג9.
גרורה
גרורות כוללות מפל רב-שלבי של אירועים שניתן לחלק לשני שלבים שרירותיים. בשלב הראשון, תאים סרטניים צריכים להתנתק מהאתר הראשי, לנדוד ולפלוש לרקמות סמוכות ולאחר מכן להיכנס למחזור הדם. בשלב השני, תאים סרטניים חייבים לשרוד במחזור הדם, פזרן מן הדם או כלי הלימפה, ולבסוף להתיישב באתרים משניים23. כדי להבחין בין אירועים מוקדמים ומאוחרים אלה ולטפל בפוטנציאל/בקיאות של תאי הגידול השונים לביצוע שלבים אלה, עיצבנו בדיקה פשוטה.
באופן כללי, כאשר מוזרק לתוך PVS, תאים סרטניים יכולים להיכנס ישירות למחזור ולאחר מכן להילכד פיזית ברקמה hematopoietic caudal (CHT) (אזור הזנב). עם זאת, על פי המאפיינים של כל תא גידול – ראינו כי כמה תאים סרטניים להישאר ב CHT 4 dpi והם מסוגלים ליצור micrometastasis בעוד תאים סרטניים אחרים נעלמים (פינה לאחר שנתפס CHT).
לכן, על ידי השוואת יעילות micrometastasis (ב 4 dpi) כאשר התאים הונחו ישירות לתוך זרימת הדם – CIRC (תאים רק צריך לעבור את השלבים המאוחרים של גרורות) לעומת כאשר לא – אין CIRC (תאים צריכים לעבור צעדים מוקדמים ומאוחרים כדי להיות מסוגל ליצור micrometastasis) אנו יכולים להעריך את הפוטנציאל גרורתי מוקדם או מאוחר שלהם. ראינו תאים סרטניים שיכולים ליצור ביעילות micrometastasis ב- CHT בשתי הקבוצות (CIRC ו- NO CIRC), מה שמרמז כי תאים אלה יש את היכולת לעבור את כל השלבים של מפל גרורתי (SW480 ו MDA-MB-468 למשל)8,11. לעומת זאת, לתאי גידול אחרים יש פוטנציאל גרורתי נמוך מאוד בשתי הקבוצות, כמעט אף פעם לא עושה micrometastasis, גם כאשר מוזרק למחזור (כלומר, גלוי CHT ב 24 hpi, אבל ב 4 dpi הם כבר לא שם, Hs578T למשל)8. עם זאת, מצאנו בבירור קבוצה אחרת – אחת כי הוא מסוגל רק ליצור micrometastasis כאשר מוזרק לתוך זרימת הדם (אנחנו יכולים רק לצפות micrometastasis בקבוצה CIRC). זה מרמז כי תאים אלה יש יעילות נמוכה בביצוע השלבים הראשונים של מפל גרורתי אבל מצד שני מסוגלים לשרוד במחזור, אקסטרווסייט ליישב אתר מרוחק.
חיסון והדמיה
לפני הקיבעון, פרוטוקול הזרקה זה יכול לשמש עבור גישות הדמיה חיה אחרות כמו מיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית חיה (DIC), מיקרוסקופיה של דיסק מסתובב, הדמיה קונפוקלית חיה ברזולוציה גבוהה ומיקרוסקופיית יריעות אור וכו ‘.
תאים מתים ופסולת תאית מופיעים בהירים כאשר הם נצפים דרך הסטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי וניתן לטעות בהם לגבי תאים חיים, במיוחד אם מטרת המחקר היא להעריך את הפוטנציאל גרורתי של קווי התאים. ברצוננו להדגיש את החשיבות של ביצוע הדמיה confocal עם סמני כדאיות ספציפיים DAPI כדי להעריך את מצב ההישרדות של הגידול micrometastasis. כמו כן, זה היסוד להשתמש בנוגדנים אנושיים ספציפיים כדי לזהות תאים אנושיים כגון מיטוכונדריה אנטי אנושית או HLA אנטי אנושי. בעת יישום הפרוטוקול, לאמן את עיני הניסוי על ידי השוואת הכתמים בסטריומיקרוסקופ עם תמונות confocal. לאחר זמן מה, ניסויים יכולים להבחין בבירור בין פסולת לתאים חיים בסטריאומיקרוסקופ הפלואורסצנטי.
למרות ששיטות אחרות לכימות נטל הגידול כגון אזור פלואורסצנטי שלם נמצאות בשימוש נרחב, אנו ממליצים לבצע הדמיה חיסונית ו confocal הר שלם כשיטה מדויקת יותר. לא רק היעילות של כתמי צבע lipophilic משתנה מאוד (כלומר, תאים מסוימים מוכתמים היטב ואילו אחרים אינם – כנראה בשל התוכן השומנים של הממברנות שלהם), אלא גם פעמים רבות צבעים ליפופילי טופס אגרגטים, ותאים מתים נוטים להיות בהירים יותר – יצירת מספר חפצים שניתן לטעות עבור תאים חיים.
תאים יכולים להיות transduced עם חלבונים פלואורסצנטיים כדי לסייע במעקב שלהם לדלג על תיוג התא. עם זאת, ודא כי תאים transduced ולא transduced לייצר את אותן תוצאות קסנוגרפטים זברה.
בנוסף, מקרופאגים יכולים phagocyte אלה פסולת תא פלואורסצנטי הופך פלואורסצנטי שכותרתו נודד, יצירת תאים גרורתיים חיוביים כוזבים. לכן, אנו ממליצים על סדרה של כלים אנליטיים, אשר כמובן ניתן להרחיב קריאות רבות אחרות לפרשנות מדויקת יותר של התנהגות הגידול:
עבור רכישה confocal עם מרווח של 5 מיקרומטר בין פרוסות מחסנית Z של תאי סרטן הבקרה HCT116 (גודל גרעיני ממוצע של 10-12 מיקרומטר קוטר) עם DAPI counterstaining, ראינו כי ~ 50% מהתאים משותפים בין שתי פרוסות רצופות. לכן, אם כל פרוסה נספרת, קיים סיכון גבוה לספירת אותם תאים פעמיים. הולך הלוך ושוב בין פרוסות כדי למנוע בעיות כימות תוצאות טכניקה זמן רב שגיאה נוטה. כדי להקל על הכימות של המספר הכולל של תאים ולאפשר רבייה רבה יותר בין החוקרים, יצרנו את הנוסחה גודל הגידול שתוארה בעבר בפרוטוקול זה8.
כללנו מספר תיקון (1.5) כדי להסביר את התאים ~ 50% המשותפים בין פרוסות. מצאנו כי השגיאה הממוצעת של ספירה ידנית של הגידול כולו בין החוקרים הייתה 20%. שני חוקרים שהשתמשו בנוסחה היו 2% שגיאה. השימוש בנוסחה זו הוא בעל שיעור דיוק של 93% ושיעור רבייה של 98%. בדקנו גם שיטות אוטומטיות, אך הן הדגימו שגיאה הגבוהה מ- 50% הנגרמת על-ידי הגדרות סף.
בשל המאפיינים של תאים אפופטוטיים, הכימות של תאי Caspase מופעל 3 קשה יותר. כדי להפחית את מספר הטעויות ואת השונות בתוצאות, אנו ממליצים כי דגימות הבקרה והניסוי נספרים על ידי אותו חוקר. בנוסף, כאשר לומדים טכניקה זו, חוקר חדש חייב לספור תמונות שכבר כימתו על ידי חוקרים מנוסים יותר כדי להשוות תוצאות ולהתאמן.
ניתן להאריך את אורך ההסתעפות במידת הצורך. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי זחלים זברה דורשים האכלה חיה החל ~ 7 ימים לאחר ההפריה (5 ימים לאחר הזרקה). בנוסף, ההנחיות והתקנות לרווחת בעלי חיים החלות על זחלים מעל גיל 6 ימים לאחר ההפריה עשויות להשתנות.
פרוטוקול זה מספק כלים שימושיים כדי לאפשר לחוקר יחיד להזריק כ ~ 200-300 זחלי זברה לשעה; ותוצאות לבדיקה המלאה, כולל ניתוח ופרשנות סטטיסטית, המתקבלות בשלושה שבועות. אנו מקווים כי פרוטוקול זה יכול לעזור לחוקרים להיות מומחים ביצירת קסנוגרפטים זברה. זה לא קל; אתה צריך להתאמן אבל תגיע לשם. בהצלחה!
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לקרן Champalimaud, קונג’נטו (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, במימון משותף של FCT/Lisboa2020) למימון. מלגות FCT לסמנכ”ל (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). כל חברי מעבדת פיור לדיונים קריטיים; ב. קוסטה ו- C. רבלו דה אלמיידה לשיתוף נתונים; וחברי המעבדה שלנו C. רבלו דה אלמיידה, מ ‘ בארוסו ול. לייטה על השתתפותם בסרטון. ברצוננו להודות למתקן הדגים CF (C. Certal, J. Monteiro et al) ולצוות התקשורת, האירועים והסיוע של Champalimaud במיוחד לאלכסנדר אזינהירה על עשיית הסרטים הפנטסטיים ולקתרינה ראמוס ותרזה פרננדס על עזרתם.
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |