यहां, हम ट्यूमर व्यवहार विश्लेषण, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और कॉन्फोकल इमेजिंग क्वांटिफिकेशन के लिए ज़ेनोग्रफ्ट और दिशानिर्देश उत्पन्न करने के सुझावों के साथ एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
ज़ेब्राफिश लार्वा ज़ेनोग्राफ्ट का व्यापक रूप से उपयोग कैंसर अनुसंधान के लिए वीवो और मानव कैंसर के वास्तविक समय के अध्ययन में करने के लिए किया जा रहा है। कैंसर विरोधी उपचारों (कीमो, रेडियोथेरेपी, और जैविक), एंजियोजेनेसिस और मेटास्टेसिस के साथ एकल सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ प्रतिक्रिया को तेजी से कल्पना करने की संभावना, प्रीक्लिनिकल अध्ययन विकसित करने के लिए जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा मॉडल को एक शीर्ष विकल्प के रूप में रखता है।
जेब्राफिश लार्वा xenograft परख अन्य मॉडलों की तुलना में कई प्रयोगात्मक लाभ प्रस्तुत करता है, लेकिन शायद सबसे हड़ताली आकार पैमाने की कमी और फलस्वरूप समय है। पैमाने की यह कमी एकल सेल इमेजिंग, मानव कोशिकाओं की अपेक्षाकृत कम संख्या (बायोप्सी के साथ संगत), मध्यम उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग का उपयोग करने की अनुमति देती है, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि परख के समय में महत्वपूर्ण कमी सक्षम हो। ये सभी फायदे भविष्य के व्यक्तिगत दवा अनुप्रयोगों के लिए जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा परख को बेहद आकर्षक बनाते हैं।
मानव ट्यूमर की व्यापक विविधता के साथ कई जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं; हालांकि, जेब्राफिश लार्वा ज़ेनोग्राफ्ट को कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए एक सामान्य और मानकीकृत प्रोटोकॉल अभी भी कमी है। यहां हम एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जिसमें ट्यूमर व्यवहार विश्लेषण, पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल इमेजिंग क्वांटिफिकेशन के लिए ज़ेनोग्रफ्ट और दिशानिर्देश उत्पन्न करने के टिप्स दिए जाते हैं।
ज़ेब्राफिश (डैनियो रेरियो) विकास और बीमारी का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली कशेरुकी मॉडल जीव के रूप में उभर रहा है। ज़ेब्राफ़िश अत्यधिक संरक्षित आनुवंशिक (~ 70% जेनेटिक होमोलॉजी और ~ 84% रोग से संबंधित जीन) और मनुष्यों के साथ बुनियादी अंग रूपात्मक विशेषताएं साझा करता है1,2। यह संरक्षण जेब्राफिश के उपयोग को कैंसर3, 4सहित कई मानव रोगों को मॉडल करने की अनुमतिदेताहै।
जेब्राफिश की हैंडलिंग और रखरखाव चूहों की तुलना में उनके छोटे आकार, पूरे वर्ष उच्च फीकीपन और बाहरी निषेचन3,5के कारण बहुत आसान और अधिक लागत प्रभावी है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण को अपने जीवन के पहले 5-7 दिनों के दौरान जीवित भोजन की आवश्यकता नहीं होती है और इसे विकास, संक्रमण औरकैंसर1, 4,6,7के लिए एक प्रभावी मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण निषेचन (एचपीएफ) के बाद 48 घंटे में निकलते हैं और सभी अंगों के साथ मुक्त तैराकी वाले जानवर हैं, एक धड़कन दिल और कार्यात्मक संचार प्रणाली, यकृत, मस्तिष्क, गुर्दे का मैरो, आदि1,3। इसके अलावा, विकास के इस चरण में केवल सहज प्रतिरक्षा खेलने पर है, अनुकूली प्रतिरक्षा अभी भी विकसित हो रही है, जिससे मानव कोशिकाओं के सामान्य कुशल एनग्रेफ्टमेंट की अनुमति मिल रही है, जिसमें इम्यूनोसमझे हुए म्यूटेंट7,8के उपयोग की कोई आवश्यकता नहीं है। फिर भी, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सभी मानव कोशिकाएं समान रूप से9 को engraft नहीं करती हैं और उदाहरण के लिए, ल्यूकेमिया कोशिकाओं के लिए यह दिखाया गया था कि फगोसाइट्स (न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज) को कुशल एनग्रफ्टमेंट10के लिए समाप्त करने की आवश्यकता है।
ज़ेब्राफ़िश जेनेटिक ट्रैक्टेबिलिटी और इसके शुरुआती भ्रूणीय चरणों की ऑप्टिकल पारदर्शिता एक उच्च संकल्प पर एकल कोशिका इंट्राविटल इमेजिंग के लिए अनुमति देती है और इस प्रकार, जीव विज्ञान के विविध क्षेत्रों में अत्याधुनिक इमेजिंग तकनीकों की स्थापना के लिए। इसके अलावा, कैंसर के संदर्भ में, ये विशेषताएं मेजबान-ट्यूमर इंटरैक्शन के शुरुआती चरणों के वास्तविक समय के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं, जैसे एंजियोजेनिक और मेटास्टैटिक क्षमता का अध्ययन करना, साथ ही जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली8,9,11,12, 13के साथ बातचीत।
हालांकि छोटे ज़ेनोबेड़ा परख में मेटास्टैटिक “विकास” के लिए कोई समय नहीं है – ट्यूमर कोशिकाओं की मेटास्टैटिक क्षमता का विश्लेषण करना संभव है (यानी, आक्रमण, इंट्रावेशन, परिसंचरण में अस्तित्व, अतिवेवास और उपनिवेशीकरण जैसे मेटास्टैटिक चरणों से गुजरना उनकी दक्षता, और इसलिए वीवो में इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करें और वास्तविक समय8,11,13,14)।
इसके जीवन चक्र की विशेषताएं जेब्राफिश को कैंसर में व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए एक अद्वितीय मॉडल के रूप में रखें। परख कम समय में की जा सकती है और कुछ ही हफ्तों में प्राप्त परिणाम7,8, 9,11,12,15,16. इन परखों की सेलेरिटी और व्यवहार्यता डॉक्टरों और शोधकर्ताओं को ट्रांसलेशनल परिणाम प्राप्त करने की संभावना प्रदान करती है जो कैंसर रोगियों के लिए उपयोगी हो सकती है, जिनके लिए समय एक आवश्यक आवश्यकता है।
सफल ज़ेब्राफ़िश भ्रूण xenografts पैदा करने में बढ़ते प्रयासों के बावजूद, इंजेक्शन प्रक्रिया के मानकीकरण के साथ-साथ इंजेक्शन के बाद सेल व्यवहार्यता और ट्यूमर व्यवहार के मूल्यांकन की अभी भी आवश्यकता है।
इस प्रोटोकॉल में हम शोधकर्ताओं को जेब्राफिश भ्रूण में मानव कैंसर सेल लाइनों के इंजेक्शन और बाद में फिक्सेशन, इम्यूनोदाते, इमेजिंग और ट्यूमर सेल व्यवहार के मात्राकरण के लिए एक स्पष्ट और विस्तृत कदम-दर-कदम गाइड प्रदान करते हैं।
कैंसर के विकास और दवा जांच के लिए एक मॉडल के रूप में जेब्राफिश के बढ़ते महत्व के परिणामस्वरूप 3 , 4,7,13,14,16,18,19,20,21. हालांकि, जेब्राफिश भ्रूण में कैंसर कोशिकाओं का इंजेक्शन एक ऐसी तकनीक है जिसके लिए उच्च स्तर की निपुणता की आवश्यकता होती है जो शोधकर्ताओं के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इस प्रोटोकॉल में हमारा उद्देश्य व्यावहारिक जानकारी और कुछ सुझाव प्रदान करना है जो जेब्राफिश भ्रूण ज़ेनोग्राफ्ट की स्थापना की प्रारंभिक चुनौतियों को दूर करने में मदद कर सकते हैं।
सेल हैंडलिंग पूर्व इंजेक्शन
सेल लाइनों के साथ जेब्राफिश क्सेनोग्राफ्ट की पीढ़ी के लिए इस अनुकूलित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के (कैंसर) कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हम अनुशंसा करते हैं कि जेब्राफिश ज़ेनोग्राफ्ट के लिए उपयोग की जाने वाली सभी सेल लाइनें माइकोप्लाज्मा मुक्त हैं। अन्य जीवाणु संदूषणों के विपरीत, कोशिका संस्कृति में माइकोप्लाज्मा की उपस्थिति ऐसे परिवर्तन उत्पन्न नहीं करती है जिन्हें माइक्रोस्कोप22के तहत आसानी से पता लगाया जा सकता है। माइकोप्लाज्मा संदूषण सेल लाइनों की एनग्रफ्टमेंट क्षमता, दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता के साथ-साथ जेब्राफिश भ्रूण की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है।
हालांकि कोशिकाओं को एक विस्तारित अवधि के लिए पैदा करने के लिए जारी रख सकते हैं, उनके फेनोटाइप और जीनोटाइप परिवर्तन के लिए प्रवण हो सकता है । संस्कृति में कोशिका रेखाओं के आकृति विज्ञान और व्यवहार से परिचित होना महत्वपूर्ण है। हम प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए 3-12 के बीच विगलन के बाद सेल मार्ग की संख्या रखने की सलाह देते हैं। इस प्रकार, नियमित माइकोप्लाज्मा परीक्षण किया जाना चाहिए।
कोशिकाओं को अपने लॉग चरण में होना चाहिए (संगम तक पहुंचने से पहले घातीय विकास चरण ~ 70%) इंजेक्शन के दिन। यह ट्यूमर की विशिष्ट पहचान का पर्याप्त एनग्रेफ्टमेंट और उचित विकास कर सकेगा। ज़ेनोबेड़ा के भीतर कोशिकाओं के फेनोटाइप में भिन्नता को रोकने के लिए, प्रयोगों के बीच निरंतर इंजेक्शन के लिए संगम को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक सेल लाइन की विशेषताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में कुछ इंजेक्शन के उच्च घनत्व की आवश्यकता हो सकती है ताकि जेब्राफिश भ्रूण में पनपे ।
सेल लेबलिंग विचार
इंजेक्शन और भविष्य के विश्लेषण के लिए मानव ट्यूमर कोशिकाओं की बेहतर कल्पना करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है। सेलुलर आकार में अंतर के कारण, अनुयायी संस्कृतियों में कोशिकाओं/सेमी2 की कुल संख्या कोशिका लाइनों के बीच भिन्न होती है । यह धुंधला प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता के साथ-साथ इंजेक्शन के लिए काटी गई कोशिकाओं की संख्या को प्रभावित करेगा। बड़ी कोशिकाएं जो प्रति फ्लास्क (यानी Hs578T) कम संख्या में पैदा होती हैं या क्लस्टर (यानी, BFTC905) में बढ़ती हैं, उन्हें एक ही प्रयोग के लिए कई फ्लास्क की पूलिंग की आवश्यकता होगी । इस मामले में, कोशिकाओं के धुंधला सीधे फ्लास्क में प्रदर्शन नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इससे डाई (उच्च लागत) की अत्यधिक मात्रा का उपयोग होगा। दूसरी ओर, कोशिकाएं जो अपकेंद्रित्र के अत्यधिक चक्रों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होती हैं और साथ ही उन लोगों को जो प्रति फ्लास्क (यानी, एचसीटी 116) उच्च संख्या में पैदा होती हैं, सीधे फ्लास्क में दाग दी जा सकती हैं और फिर EDTA/सेल स्क्रैपर के साथ अलग हो सकती हैं (अधिक जानकारी के लिए तालिका 1देखें)।
जब भी संभव हो, एंजाइमेटिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के बजाय, इंजेक्शन के दिन कोशिकाओं को अलग करने के लिए ईडीटीए का उपयोग करें, ताकि कोशिकाएं अपने सेल-सेल जंक्शनों को अधिक तेजी से ठीक करें और कम अपकेंद्रित्र चरणों के अधीन हों। फिर भी, यदि कोशिकाएं EDTA के प्रति संवेदनशील हैं, तो बहुत अनुयायी या समूहों में वृद्धि होती है – एक एंजाइमेटिक विधि लागू की जा सकती है। इंजेक्शन के साथ-साथ इंजेक्शन माध्यम के लिए आदर्श एकाग्रता का अनुकूलन प्रत्येक सेल लाइन की विशेषताओं पर निर्भर है, इस प्रकार इसे कुछ समायोजन(तालिका 1)की आवश्यकता हो सकती है।
माइक्रोइंजेक्शन अंशांकन
जेब्राफिश भ्रूण में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स या दवाओं के वितरण के विपरीत, ज़ेनोग्राफ के लिए सेल लाइनों के साथ काम करते समय सुई को कैलिब्रेट करने के लिए एक ग्रेटिकल का उपयोग नहीं किया जाता है। इंजेक्शन के दौरान कुछ समय बाद, कोशिकाएं रोकना शुरू कर देंगी, और इसके व्यास को बढ़ाने या सुई को पूरी तरह बदलने के लिए सुई की नोक को काटना आवश्यक है। यह प्रक्रिया ग्रेटिकल कैलिब्रेशन में बाधा डालती है।
इस समस्या को हल करने के लिए, तिरस्कृत कोशिकाओं की संख्या को 1-3 दालों के भीतर भ्रूण आंख के समान आकार तक पहुंचने के लिए आवश्यक दबाव और समय को बाहर निकालने के द्वारा विनियमित किया जाता है। फिर, ट्यूमर के आकार को और नियंत्रित करने के लिए, 1 डीपीआई पर, जेनोग्राफ्ट को ट्यूमर के आकार के अनुसार हल किया जाता है जैसा कि चित्र 6 बी-बीमें दिखाया गया है। जैसा कि चित्रा 6C उदाहरण में दर्शाया गया है, छंटाई की यह विधि ट्यूमर के आकार की भिन्नता को कम करने में कुशल है: यदि हम उन सभी को एक साथ पूल करते हैं (+, ++, +++++ एसटीईवी + वर्ग (~ 906 कोशिकाओं से ~ 422 कोशिकाओं) का ~ दोगुना है और गुणांक भिन्नता + + वर्ग में 14,5% की तुलना में ~ 31.9% है। चूंकि इंजेक्शन के लिए संदर्भ मात्रा है, कोशिकाओं की कुल संख्या कोशिका प्रकारों के बीच बहुत भिन्न होती है – कोशिकाओं के आकार और आकार पर निर्भर होना। उदाहरण के लिए, स्तन कैंसर Hs578T जैसे बहुत सारे साइटोप्लाज्म वाली बड़ी कोशिकाएं, बहुत छोटे ट्यूमर (~ 600 कोशिकाओं) का उत्पादन करती हैं। इसके अलावा, प्रत्येक सेल लाइन कोशिकाओं की अलग-अलग संख्या की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, HT29 सीआरसी और RT112 मूत्राशय कैंसर सेल लाइनों से पता चला है कि कोशिकाओं की संख्या अधिक इंजेक्शन, जेब्राफिश मृत्यु दर अधिक है । इसलिए, यदि कोशिका रेखा भ्रूण में विषाक्त प्रभाव पड़ता है या इंजेक्शन के उच्च/कम घनत्व की आवश्यकता होती है तो परीक्षण करने के लिए ज़ेनोग्रफ्ट विकसित करते समय अनुकूलन की अवधि की आवश्यकता होती है।
इंजेक्शन साइट
ज़ेब्राफ़िश भ्रूण ज़ेनोग्राफ़ पैदा करते समय सबसे आम विसंगतियों में से एक इंजेक्शन की साइट है। जर्दी आमतौर पर अपनी आसान पहुंच के कारण इंजेक्शन के लिए पसंद की जगह है। हालांकि, हमने देखा है कि जर्दी में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं में मरने की प्रवृत्ति अधिक होती है । हालांकि तकनीकी रूप से अधिक कठिन है, हम पीवीएस में इंजेक्शन और जहां तक संभव हो दिल से सलाह देते हैं। पीवीएस के भीतर, कोशिकाएं कुल, जहाजों और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती कर सकती हैं, और यदि मेटास्टैटिक विशेषताओंकोप्रदर्शित करती हैं, तो इंट्रावेट, एक्सट्रावेट और फॉर्म माइक्रोमेटास्टेसिस स्थानांतरित करसकतीहैं।
एनग्रफ्टमेंट दक्षता
4 डीपीआई पर सेल लाइनों के बीच एनग्रफ्टमेंट दक्षता और ट्यूमर के आकार में अंतर बेसल सेल डेथ/सर्वाइवल/प्रसार की अपनी अलग डिग्री के कारण, लेकिन यह भी जन्मजात इम्यूनोजेनिसिटी के कारण उम्मीद है कि प्रत्येक सेल लाइन9प्रदर्शित कर सकती है ।
मेटास्टेसिस
मेटास्टेसिस में घटनाओं का एक बहुस्टेप झरना शामिल है जिसे दो मनमाने चरणों में विभाजित किया जा सकता है। पहले चरण में, ट्यूमर कोशिकाओं को प्राथमिक स्थल से अलग करना पड़ता है, आसन्न ऊतकों को स्थानांतरित करना और आक्रमण करना होता है और फिर खून में बदलना पड़ता है। दूसरे चरण में, ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचरण में जीवित रहना चाहिए, रक्त या लसीका जहाजों से अतिव्यवसंवणित करना चाहिए, और अंत में माध्यमिक साइटों पर उपनिवेश23। इन शुरुआती और देर से घटनाओं के बीच अंतर करने और इन चरणों को करने के लिए विभिन्न ट्यूमर कोशिकाओं की क्षमता/प्रवीणता को संबोधित करने के लिए, हमने एक सरल परख तैयार की ।
सामान्य तौर पर, जब पीवीएस में इंजेक्शन दिया जाता है, तो ट्यूमर कोशिकाएं सीधे परिसंचरण में प्रवेश कर सकती हैं और फिर शारीरिक रूप से कौडल हेमेटोपोइटिक ऊतक (सीएचटी) (पूंछ क्षेत्र) में फंस जाती हैं। हालांकि, प्रत्येक ट्यूमर सेल की विशेषताओं के अनुसार – हमने देखा है कि कुछ ट्यूमर कोशिकाएं सीएचटी 4 डीपीआई पर रहती हैं और माइक्रोमेटास्टेसिस बनाने में सक्षम होती हैं जबकि अन्य ट्यूमर कोशिकाएं गायब हो जाती हैं (सीएचटी में पकड़े जाने के बाद मंजूरी दे दी गई)।
इसलिए, माइक्रोमेटास्टेसिस दक्षता (4 डीपीआई पर) की तुलना करके जब कोशिकाओं को सीधे परिसंचरण में रखा गया था – सीआईआरसी (कोशिकाओं को केवल मेटास्टेसिस के देर से चरणों के माध्यम से जाना पड़ता है) बनाम जब नहीं – कोई सीआईआरसी (कोशिकाओं को माइक्रोमेटास्टेसिस बनाने में सक्षम होने के लिए जल्दी और देर से कदम उठाने की आवश्यकता होती है) हम उनकी शुरुआती या देर से मेटास्टैटिक क्षमता का आकलन कर सकते हैं। हमने ट्यूमर कोशिकाओं को देखा है जो दोनों समूहों (सीआईआरसी और एनईआरसी) में सीएचटी में माइक्रोमेटास्टेसिस को कुशलतापूर्वक बना सकते हैं, सुझाव देते हैं कि इन कोशिकाओं में मेटास्टैटिक झरना (SW480 और एमडीए-एमबी-468 उदाहरण के लिए)8,11के सभी चरणों से गुजरने की क्षमता है। इसके विपरीत, अन्य ट्यूमर कोशिकाओं में दोनों समूहों में बहुत कम मेटास्टैटिक क्षमता होती है, शायद ही कभी माइक्रोमेटास्टेसिस बनाते हैं, यहां तक कि जब संचलन में इंजेक्ट किया जाता है (यानी, 24 एचपीआई में सीएचटी में दिखाई देता है, लेकिन 4 डीपीआई में वे अब वहां नहीं हैं, उदाहरण के लिए Hs578T)8। हालांकि, हमें स्पष्ट रूप से एक और समूह मिला है – एक जो केवल परिसंचरण में इंजेक्शन होने पर माइक्रोमेटासिस बनाने में सक्षम है (हम केवल सीआईआरसी समूह में माइक्रोमेटास्टेसिस का निरीक्षण कर सकते हैं)। इससे पता चलता है कि मेटास्टैटिक झरना के पहले चरणों को करने में इन कोशिकाओं की दक्षता कम होती है लेकिन दूसरी ओर परिसंचरण में जीवित रहने, अतिवेवण और एक दूर की साइट उपनिवेश करने में सक्षम हैं।
इम्यूनोदाता और इमेजिंग
निर्धारण से पहले, इस इंजेक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग लाइव अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी, कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी, हाई-रेजोल्यूशन लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग और लाइट शीट माइक्रोस्कोपी आदि जैसे अन्य लाइव इमेजिंग दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है।
फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से मनाए जाने पर मृत कोशिकाएं और सेलुलर मलबे उज्ज्वल दिखाई देते हैं और जीवित कोशिकाओं के लिए गलत हो सकते हैं, खासकर यदि अध्ययन का उद्देश्य कोशिका रेखाओं की मेटास्टैटिक क्षमता का आकलन कर रहा है। हम ट्यूमर और माइक्रोमेटास्टेसिस के अस्तित्व की स्थिति का आकलन करने के लिए विशिष्ट व्यवहार्यता मार्कर और DAPI के साथ कॉन्फोकल इमेजिंग प्रदर्शन के महत्व पर जोर देना चाहते हैं। इसके अलावा, मानव विरोधी माइटोकॉन्ड्रिया या मानव विरोधी एचएलए जैसी मानव कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट मानव एंटीबॉडी का उपयोग करना मौलिक है। प्रोटोकॉल को लागू करते समय, कॉन्फोकल छवियों के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में धुंधला की तुलना करके प्रयोगकर्ता आंखों को प्रशिक्षित करें। कुछ समय बाद, प्रयोगकर्ता फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप में जीवित कोशिकाओं से मलबे को स्पष्ट रूप से अलग कर सकते हैं।
यद्यपि ट्यूमर के बोझ जैसे पूरे फ्लोरेसेंस क्षेत्र को व्यापक रूप से निर्धारित करने के अन्य तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, हम पूरे माउंट इम्यूनोदाता और कॉन्फोकल इमेजिंग को अधिक सटीक विधि के रूप में प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं। न केवल लिपोफिलिक डाई धुंधला की दक्षता बहुत चर है (यानी, कुछ कोशिकाएं बहुत अच्छी तरह से दाग रही हैं जबकि अन्य नहीं हैं – शायद उनकी झिल्ली की लिपिड सामग्री के कारण), लेकिन कई बार लिपोफिलिक रंग भी एकत्रित होते हैं, और मृत कोशिकाएं उज्जवल होती हैं – कई कलाकृतियों का निर्माण करना जो जीवित कोशिकाओं के लिए गलत हो सकते हैं।
कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है ताकि वे अपनी ट्रैकिंग में सहायता कर सकें और सेल लेबलिंग को छोड़ सकें । हालांकि, सुनिश्चित करें कि ट्रांसड्यूडेड और गैर-ट्रांसड्यूड कोशिकाएं जेब्राफिश ज़ेनोग्राफ्ट में समान परिणाम उत्पन्न करती हैं।
इसके अलावा, मैक्रोफेज इन फ्लोरोसेंट सेल मलबे को फ्लोरोसेंट रूप से लेबल और माइग्रेट कर सकते हैं, जिससे झूठी सकारात्मक मेटास्टैटिक कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं। इस प्रकार, हम विश्लेषणात्मक उपकरणों की एक श्रृंखला की सलाह देते हैं, जिसे निश्चित रूप से ट्यूमर व्यवहार की अधिक सटीक व्याख्या के लिए कई अन्य readouts तक बढ़ाया जा सकता है:
नियंत्रण कैंसर कोशिकाओं HCT116 (व्यास के 10-12 माइक्रोन के औसत परमाणु आकार) के जेड-स्टैक में स्लाइस के बीच 5 माइक्रोन अंतराल के साथ एक कॉन्फोकल अधिग्रहण के लिए, हमने देखा है कि ~ 50% कोशिकाओं को लगातार दो स्लाइस के बीच साझा किया जाता है। इसलिए, यदि हर टुकड़ा गिना जाता है, तो एक ही कोशिकाओं को दो बार गिनने का खतरा अधिक होता है। मात्राकरण में समस्याओं से बचने के लिए स्लाइस के बीच आगे-पीछे जा रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप समय लेने वाली और त्रुटि प्रवण तकनीक होती है। कोशिकाओं की कुल संख्या की मात्रा को कम करने और शोधकर्ताओं के बीच अधिक प्रजनन क्षमता के लिए अनुमति देने के लिए, हमने पहले इस प्रोटोकॉल8में वर्णित ट्यूमर आकार फार्मूला बनाया।
हमने स्लाइस के बीच साझा ~ 50% कोशिकाओं के लिए खाते में एक सुधार संख्या (1.5) शामिल किया। हमने पाया कि शोधकर्ताओं के बीच पूरे ट्यूमर की मैनुअल गिनती की औसत त्रुटि 20% थी । सूत्र का उपयोग कर दो शोधकर्ताओं में 2% त्रुटि थी। इस फॉर्मूले के इस्तेमाल में 93% सटीकता दर और 98% प्रजनन दर है। हमने स्वचालित तरीकों का भी परीक्षण किया, लेकिन उन्होंने थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स के कारण 50% से अधिक त्रुटि का प्रदर्शन किया।
एपोप्टोटिक कोशिकाओं की विशेषताओं के कारण, सक्रिय कैस्पाज़ 3 कोशिकाओं का मात्राकरण अधिक कठिन है। गलतियों की संख्या और परिणामों में भिन्नता को कम करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों को एक ही शोधकर्ता द्वारा गिना जाता है। इसके अतिरिक्त, जब इस तकनीक को सीखने, एक नए शोधकर्ता छवियों है कि पहले से ही अधिक अनुभवी शोधकर्ताओं द्वारा मात्रा निर्धारित करने के लिए परिणाम और ट्रेन की तुलना में गिनती चाहिए ।
जरूरत पड़ने पर परख की लंबाई बढ़ाई जा सकती है। हालांकि, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि जेब्राफिश लार्वा को निषेचन के बाद ~ 7 दिनों (इंजेक्शन के बाद) से शुरू लाइव फीडिंग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, निषेचन के बाद 6 दिनों से पुराने लार्वा पर लागू पशु कल्याण दिशानिर्देश और विनियम भिन्न हो सकते हैं।
यह प्रोटोकॉल एक एकल शोधकर्ता को प्रति घंटे लगभग ~ 200-300 जेब्राफिश लार्वा इंजेक्ट करने में सक्षम बनाने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान करता है; और विश्लेषण और सांख्यिकीय व्याख्या सहित पूर्ण परख के लिए परिणाम, तीन सप्ताह में प्राप्त की । हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को जेब्राफिश ज़ेनोबेड़ा पैदा करने में विशेषज्ञ बनने में मदद कर सकता है। यह आसान नहीं है; आप अभ्यास करने की जरूरत है, लेकिन आप वहां मिल जाएगा । शुभकामनाएँ!
The authors have nothing to disclose.
हम चंपालिमौद फाउंडेशन, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, सह एफसीटी द्वारा वित्त पोषित/Lisboa2020) के वित्तपोषण के लिए धन्यवाद । वीपी के लिए एफसीटी फैलोशिप (एसएफआरएच/बीडी/118252/2016), एमएमएल (पीडी/बीडी/138203/2018) । महत्वपूर्ण चर्चाओं के लिए फियोर लैब के सभी सदस्य; डेटा साझा करने के लिए बी कोस्टा और सी रेरेलो डी अल्मेडा; और हमारे लैब सदस्यों सी रेरेलो डी अल्मेडा, एम बरासो और एल Leite वीडियो में उनकी भागीदारी के लिए । हम सीएफ फिश फैसिलिटी (सी सेर्टल, जे मोंटेरो एट अल) और चंपालिमौद कम्युनिकेशन, इवेंट्स एंड आउटरीच टीम को शानदार फिल्म मेकिंग और कातारीना रामोस और टेरेसा फर्नांडिस को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे ।
Agar for bacteriology | VWR | 97064-336 | Agar plate |
anti-Caspase3Asp175 (Rabbit monoclonal) | Cell Signalling Technologies | 9661 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti-human HLA (Rabbit monoclonal) | Abcam EP1395Y | ab52922 | Primary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:100) |
anti- 488 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35552 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
anti- 594 (Rabbit monoclonal) | ThermoFisher Scientific | 35560 | Secondary antibody for whole mount immuno staining (Dilution 1:200) |
CellTracker Deep Red Dye | ThermoFisher Scientific | C34565 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
CellTracker Green CMFDA Dye | ThermoFisher Scientific | C2925 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Conical Centrifuge tube 50mL | VWR | 525-0610 | |
Conical Centrifuge tube 15mL | VWR | 525-0604 | |
DAPI | Nuclear and chromosome counterstain | ||
Laser-Based Micropipette Puller P-2000 | Sutter-Instrument | Micropipette Puller | |
Microcentrifuge tube 1.5mL | Abdos | P10202 | |
Microscope slides, cut edge | RS France | BPB016 | Slides for mounting |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Mounting medium |
Pneumatic Picopump | World Precision Instruments | PV820 | Microinjector |
Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | ThermoFisher Scientific | 631-9430 | Coverslips for mounting |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | Agar plate |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100-4 | Borosilicate capillaries |
TrypLE | Gibco | 12605036 | Enzymatic detachment solution |
Vaseline | Petroleum jelly for slide sealing | ||
Vybrant CM-DiI Dye | ThermoFisher Scientific | V22888 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | ThermoFisher Scientific | V22886 | Lipophilic dye (Dilution 1:1000) |
ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology | ZEISS | Fluorescence Stereo Zoom Microscope | |
Zeiss LSM 710 | ZEISS | Confocal microscope |